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pEGFPN1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达. 方法 根据pcD-NA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性. 结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600 bp,与理论值相符.构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700 bp和约2 600 bp的两条片段,与预期相符.对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变.免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40 mg/ml.提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别. 结论 成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础.
关键词： pEGFP-N1 载体构建 HBsAg-p30 ROP2 蛋白表达 -
T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期调节的研究
目的 探讨T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期的影响.方法 应用脂质体LipofectamineTM2000将构建的pEGFP-N1-T-钙黏蛋白以及pEGFP-N1空载体转染至B16F10 细胞,OPTI-MEM培养基体外培养6 h 后RPMI-1640继续培养24 h,应用碘化丙啶标记,流式细胞仪检测T-钙黏蛋白对B16F10黑素瘤细胞周期的影响.结果 转染T-钙黏蛋白组G0/G1期和G2/M期细胞比率分别为(60.917±1.897)%、(8.513±0.651)%,明显高于未转染组的(53.563±1.856)%、(2.627±0.434)%和pEGFP-N1空载体组的(53.880±2.164)%、(2.770±0.466)%,差异有显著性(P<0.05);转染T-钙黏蛋白组S期细胞比率为(30.570±1.368)%,低于未转染组的(43.810±2.003)%及pEGFP-N1空载体组的(43.350±2.629)%,差异有统计学意义(P<0.05).未转染组与转染pEGFP-N1空载体组各期差异均无统计学意义(P>0.05).结论 T-钙黏蛋白使B16F10细胞G0/G1期和G2/M期比率增高,S期比率降低.
关键词： T-钙黏蛋白 B16F10黑素瘤细胞 pEGFP-N1 细胞周期 流式细胞技术 -
pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建
[目的]构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础.[方法]设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoli.DH5(大肠杆菌),大量扩增重组质粒.试剂盒纯化重组质粒.用LipofectamineTM2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达. [结果]pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Western blotting检测融合蛋白分子量为47 kd,符合预期值.[结论]成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-synuclein.
关键词： 帕金森病 α-synuclein pEGFP-N1 真核表达 融合蛋白 -
pEGFP-N1脂质体转染方法的优化及其应用
目的:应用脂质体介导的转染方法将pEGFP-N1转染入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中,并获得较佳的优化方案,阐明该优化条件在转染其他目的基因时的适用性.方法:分别选取不同配比的质粒和脂质体,将pEGFP-N1转入Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞.转染后36 h,倒置荧光显微镜和流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率;台盼蓝染色法检测细胞存活率,以此获得优化的转染条件.同时将pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5分别以上述条件转染,并获取相应优化的转染条件.结果:在质粒质量固定的条件下,随着脂质体质量的增加,其转染效率和细胞存活率升高;但是当质粒:脂质体＞1∶4时,转染效率和细胞存活率下降.在质粒和脂质体比例固定而质量增加时,其转染效率和细胞存活率下降;当质粒:脂质体＞3.2 μg∶12.8μL时,转染效率降低.应用脂质体介导的方法转染pEGFP-N1和转染pEGFP-Aquaporin2、pEGFP-Aquaporin4和pEGFP-Aquaporin5时,在质粒与脂质体的配比为1∶4(3.2 μg∶12.8 μL)时,转染效率达高.结论:在应用脂质体介导的目的基因转染时,pEGFP-N1优化的转染条件具有较为广泛的适用性,可用作后续目的基因高效转染优化条件.
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IL-17真核表达载体的构建及其在胶质瘤细胞株U87MG中的表达与筛选
IL-17可以通过多种途径促进肿瘤发展,前期工作发现胶质瘤组织中IL-17高表达,本研究拟构建IL-17真核表达载体pEGFP-N1-IL-17,并且稳定转染胶质瘤细胞株U87MG,为研究IL-17在胶质瘤中作用提供基础.取血小板减少性紫癜自愿患者外周血2ml,Ficoll分离PBMC,提取RNA后经含BamH Ⅰ及Sal Ⅰ酶切位点引物逆转录成cDNA,连接T载体,酶切后与经相同酶切的载体pEGFP-N1连接,卡那霉素筛选,重组载体经Xfect试剂转染胶质瘤细胞U87MG,以G418筛选,单克隆阳性株扩大培养,经荧光、Real Time PCR及ELISA鉴定.构建真核表达载体pEGFP-N1-IL-17测序正确.经荧光、Real Time PCR、ELISA检测稳定转染细胞株pEGFP-N1-IL-17-U87MG成功,IL-17转染后U87MG细胞MCP-1分子表达下调.因此,本研究成功构建IL-17真核表达载体pEGFP-N1-IL-17,并稳定转染U87MG,为研究IL-17在胶质瘤中作用提供了基础.
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具有双层结构和负电荷屏障载体的构建及其基因转染
用组氨酸分别修饰聚乙烯亚胺(PEI)和透明质酸,得到了聚乙烯亚胺-组氨酸(PEI-His)和透明质酸-组氨酸(HA-His).然后将PEI-His与增强型绿色荧光蛋白质粒DNA (pEGFP-N1)复合形成PEI-His/DNA复合物(PD复合物),并进一步在其表面吸附HA-His形成具有双层结构和负电屏障的(PEI-His/DNA)/HA-His复合物(HPD复合物),用于基因传递研究.透射电镜观察到HPD复合物为球形纳米粒子,水化后平均粒径约为142 nm,ζ电位为-28.9 mV.HPD复合物中加入10％胎牛血清后平均粒径为135 nm,ζ电位为-25.8 mV,提示其具有良好的血清稳定性.HPD复合物对pEGFP-N1的包载效率为(91.9+115)％,并可有效保护DNA不被DNase I降解.在PEI浓度5～20 μg/ml范围内,HPD复合物的细胞毒性明显低于PEI/DNA复合物,前者细胞存活率可维持在80％以上;同时,它可介导DNA进入细胞实现基因转染,转染效率为2.88％.
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野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒构建
目的构建人野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1质粒.方法采用RT PCR方法从人胚脑组织中扩增出人泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)基因,插入至pMD18-T vector中;再采用SOE法定点突变,通过酶切和连接,构建野生型和C279G突变型pEGFP-N1-UCHL1.结果酶切和DNA测序证实,野生型和突变型UCHL1基因分别插入到pEGFP-N1中,野生型UCHL1基因序列与GenBank完全一致,C279G突变型UCHL1基因除第279位碱基C被G替代以外,其余序列与野生型完全一致.结论成功构建野生型和C279G突变型UCHL1基因真核表达质粒.
关键词： 泛素羧基末端水解酶1 pEGFP-N1 定点突变 -
pEGFP-N1-HBsAg-ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定
目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础.方法 根据HBsAg基因序列和pcDNA3-p30-ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBsAg基因,经酶切、连接、转化,利用HBsAg基因替换p30基因,构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBsAg-ROP2片段与pEGFP-N1真核表达载体相连,构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平.结果 HBsAg片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符.pEGFP-N1-HBsAg-ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与GenBank发表的序列同源性为99.84%.目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml.结论 成功构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达.
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pEGFP-N1-Snail真核表达质粒的构建与表达
目的:构建pEGFP-N 1 Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达.方法:利用RT-PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序(重组质粒双酶切后与pEGFP-N 1真核表达载体连接,构建pE(;FP-N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功.分别抽提pEGFP-N1及pEGFP-N 1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT-PCR检测Snail在该细胞中表达.结果:本实验成功构建了pEGFP-Nl-Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达.结论:本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础.
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基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达
目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.
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pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定
目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒，并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段，与pMD18-T载体连接，构建pMD18-T-PEDF重组质粒，酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接，构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒，进行测序、酶切鉴定，表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。
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小鼠GITRL基因真核表达质粒的构建转染及其在Kupffer细胞中的表达
目的 构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,体外转入小鼠Kupffer细胞.方法 利用PCR方法扩增GITRL基因,克隆至pEGFP-N1载体,选择阳性克隆并进行序列测定.以脂质体化学法转染至Kupffer细胞中.结果 构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外瞬时转染Kupffer细胞,RT-PCR及WB检测该Kupffer细胞表达GITRL.结论 成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-GITRL,并在小鼠Kupffer细胞成功表达,为进一步研究GITRL在Kupffer细胞中的的生物学功能提供研究基础.
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含绿色荧光蛋白基因重组质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合的重组真核表达载体,并转染大鼠血管平滑肌细胞(A7r5),观察其在A7r5中的表达.方法 采用Trizol法快速提取A7r5的总RNA,经RT-PCR获得线粒体融合蛋白2(mfn2)的cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段.用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切扩增的大鼠mfn2基因片段和质粒pEGFP-N1,然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌DH5α.将提取的重组质粒进行酶切鉴定和测序.测序正确的重组质粒用脂质体法转染A7r5,24h后观察GFP表达情况,并用RT-PCR、Western blot方法检测mfia2的表达.结果 扩增出了1条约2.2 kb的片段,酶切结果显示重组质粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1载体和2.2kb大小的目的片段.经测序目的片段的序列与GeneBank中大鼠mfn2基因的开放阅读编码框序列完全一致.细胞转染48h后GFP表达量多,RT-PCR、Western blot方法检测到mfn2在A7r5中高表达.结论 成功构建了含GFP基因重组真核表达载体,并且可以在A7r5中高表达.
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大鼠组织因子基因克隆及其在C6细胞系中的表达
目的:克隆大鼠组织因子(tissue factor,TF)基因,构建真核表达载体pEGFP-N1-TF,转染C6大鼠神经胶质瘤细胞并检测转染细胞内TF表达水平.方法:采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织中扩增TF基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1上.通过测序鉴定重组质粒中插入TF的完整性和可靠性.应用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转入C6细胞中,荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率,并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测.结果:成功构建pEGFP-N1-TF真核表达载体,转染C6细胞24 h后,在荧光显微镜下可以观测到荧光,并通过Western blot技术检测到TF-eGFP融合蛋白的表达.结论:重组真核表达载体pEGFP-N1-TF构建成功,转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达.
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抗心肌肥大多肽GCIP表达载体的构建
目的化学合成DNA片段后利用基因工程技术,克隆入含有T7启动子的原核表达质粒.方法采用分二段化学合成G蛋白竞争性抑制肽(G-protein competed inhibition of peptide, GCIP)基因的方法,酶切后先定向克隆到pEGFP-N1质粒中,再用XhoⅠ和SmaⅠ切下含完整基因的片段,插入XhoⅠ和SmaⅠ处理的pIVEX2.3-MCS质粒,构建能在E coli BL21(DE3)pLysE和RTS500系统中表达的质粒.经转化DH5α大肠杆菌,筛选出阳性转化子,并用酶切及测序鉴定.结果通过基因工程技术,构建了pIVEX2.3MCS-GCIP表达质粒,经测序鉴定结果与设计的完全相符.结论成功构建了GCIP的重组表达质粒.
关键词： GCIP基因 重组 pIVEX2.3-MCS pEGFP-N1 -
MicroRNA-21、PTEN基因真核及shRNA表达载体构建
为了构建microRNA-21、第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)真核表达载体pEGFP-N1-pre-miR21、pEGFP-N1-PTEN及短发夹状RNA(shRNA)表达载体Psilencer4.1-CMV-mir21-shRNA、Psilencer4.1-CMV-PTEN-shRNA,我们根据microRNA-21、PTEN基因序列设计合成shRNA及PCR引物；将microRNA-21、PTEN shRNA片段退火后的DNA模板定向克隆到Psilencer4.1-CMV质粒；另采用RT-PCR技术从人结肠癌细胞HCT-116中扩增pre-miR-21及PTEN,并将PCR产物双酶切后定向克隆到pEGFP-N1质粒上,构建重组载体.经菌落筛选、双酶切及DNA测序分析检测重组载体构建是否成功.结果显示筛选出的阳性克隆经双酶切鉴定得到与载体及目的片段大小一致的两条片段.测序证实目的基因pre-miR-21、PTEN及其shRNA序列分别正确连接到pEGFP-N1及Psilencer4.1-CMV的多克隆位点.结论:成功构建microRNA-21、PTEN基因真核表达及shRNA表达载体,为进一步研究microRNA-21及PTEN基因在结直肠癌中的作用奠定了基础.
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阳离子脂质体介导BEL-7402、QBC、BXPC-3瞬时转染率比较
目的: 探讨阳离子脂质体瞬时转染消化道肿瘤细胞的差异.方法: 采用pEGFP-N1质粒为报告基因,流式细胞仪技术(FACS)来分析阳离子脂质体介导3种细胞的瞬时转染率,设立裸质粒的转染为空白对照组,将转染的细胞在倒置荧光显微镜下观察并摄像;采用MTT法检测3种细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间和阳离子脂质体介导的转染之间的联系.结果: BEL-7402,QBC,BXPC3 3系细胞阳离子脂质体介导的瞬时转染率分别为26.99%、2.25%和30.36%,BEL-7402和BXPC-3同QBC细胞有显著差异(P＜0.05);3个细胞系裸质粒的转染率分别为0.22%、0.29%和0.18%,3者之间差异无显著性(P＞0.05);BEL-7402、QBC、BXPC-3的倍增时间分别是34.48 h、64.94 h和26.29 h,QBC细胞同BEL-7402及BXPC-3相比差异有显著性(P＜0.05).结论: 阳离子脂质体对高度恶性的消化道肿瘤细胞有更好的转染效率.
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重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达
目的 构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究.方法 通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中.通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性.结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集.结论 成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集.
