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脑瘤手术患者咽喉部吸取液中耶氏肺孢子菌的筛查
目的 采用常规PCR、巢式PCR(Nest PCR,nPCR)和定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)检测耶氏肺孢子菌(Pneumoc ystisjirovecii,Pj)特异性核酸片段,调查脑瘤手术患者咽喉部吸取液中的Pj. 方法 选取无肺炎脑瘤手术患者108例,留取手术咽喉部吸取液,分别以线粒体大亚基rRNA(Mitochondrial large subunit rRNA,mtLSUrRNA)为靶基因的常规PCR(Mt-PCR)和巢氏PCR(Mt-nPCR),以及主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,Msg)为靶基因的常规PCR(Msg-PCR),检查咽喉部吸取液中Pj特异性核酸片段,阳性标本进行qPCR,检测分别以mtLSUrRNA和Msg为靶基因的拷贝数. 结果 108例脑瘤手术患者咽部吸取液Mt-nPCR、Msg-PCR及MtPCR扩增阳性率率分别为41.7％(45/108)、15.7％ (17/108)和4.6％(5/108),其中3种检测方法同为阳性1例(占0.9％),任意2种方法阳性11例(占10.2％),Mt-nPCR和Msg-PCR任意1种方法阳性42例(占38.9％),3种方法均阴性54例(占50.0％).54例PCR检测阳性的标本同时进行mtLSUrRNA定量PCR(Mt-qPCR)和Msg定量PCR (Msa-qPCR)检测,其中Mt-qPCR检测为100～999拷贝/μl2例(占3.7％),1 000～9 999拷贝/μl有49例(占90.7％),≥10 4拷贝/μl有3例(占5.6％);Msg-qPCR检测为1 000～9 999拷贝/μl 14例(占25.9％),10 000～99 999拷贝/μl 21例(占38.9％),100 000～999 999拷贝/μl 14例(占25.9％),≥106拷贝/μl有5例(占9.3％).54例中Msg-qPCR拷贝数＞Mt-qPCR拷贝数51例(占94.4％),Msg-qPCR拷贝数＜Mt-qPCR拷贝数3例(占5.6％). 结论 核酸扩增法检测脑瘤手术患者咽喉部吸取液Pj阳性率为50.0％,其中MtqPCR检测多数为103拷贝/μl,Msg qPCR检测多数为103～105拷贝/μl,解读需谨慎.
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实时TaqMan PCR技术在兽医学中的应用
1介绍1985年,首先出现了检测核酸的高度灵敏和特异性的聚合酶链式反应(PCR),这一技术使研究和诊断实现了革命化.定量PCR是已建立了的简单技术,但定量样品中特异的核苷酸是一急需解决的任务.
关键词： 实时TagMan PCR技术 常规PCR 病原检测 基因表达 等位基因的鉴别 -
NDM1基因常规PCR与荧光定量PCR检测方法的建立及其检测结果比较
目的:建立NDM1基因常规PCR和荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并对其检测结果进行比较.方法:设计3对NDM1基因常规PCR与FQ-PCR引物,建立常规PCR与FQ-PCR反应体系和条件,比较2种检测方法的特异性、灵敏度和对模拟临床样品的检测效果.结果:成功建立NDM1基因常规PCR和FQ-PCR检测方法；特异性检测,常规PCR与FQ-PCR检测7种常见病原菌均为阴性；灵敏度检测,常规PCR检测限为106 mL-1,FQ-PCR检测限为104 mL-1；模拟临床样品检测,常规PCR和FQ-PCR检测结果一致.结论:常规PCR与FQ-PCR均有很好的特异性,FQ-PCR灵敏度比常规PCR高100倍.
关键词： 新德里金属-β-内酰胺酶1基因 常规PCR 荧光定量PCR -
SSR-PCR和常规PCR检测不同地区并殖吸虫遗专变异的比较研究
目的 以SSR-PCR和常规PCR对浙江省和福建省5个不同地区并殖吸虫进行遗传变异检测,比较两者对并殖吸虫的基因水平分类的差异.方法 采用微卫星锚定PCR (SSR-PCR)对基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物按Nei的方法计算遗传距离,并应用SPSS软件构建系统进化树；采用常规PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚单位(C()I)及核糖体DNA第二间区(ITS2)的基因序列,测序后用BoiEdit软件分析同源性,用MEGA软件构建种系发生树.结果 不同地区并殖吸虫标本的SSR-PCR产物呈多态性,浙江金华、浙江永嘉、福建周宁与福建平和、福建政和的标本存在明显的差异.前两者的遗传距离近,为0.3333,浙江金华与福建平和的标本遗传距离远,为0.8667.常规PCR基因序列分析显示浙江金华、浙江永嘉、福建周宁的标本之间在种系发生树上比较接近,浙江金华和浙江永嘉的标本为接近.结论 利用SSR-PCR和常规PCR进行并殖吸虫的遗传变异分析结果基本一致.SSR-PCR是一种比常规PCR更方便的并殖吸虫遗传变异研究方法.
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荧光PCR、常规PCR和细胞培养在流感检测中的对比分析
目的 比较当地已有的3种流感病毒检测方法的差异,以确定它们在不同情形下的适用方向.方法 通过荧光PCR(聚合酶链反应)、常规PCR和细胞培养3种方法同时检测413份流感样病例(ILI)咽拭子样本,计算出它们的灵敏度和特异度,并进行统计分析.结果 荧光PCR、常规PCR和细胞培养的阳性检测率分别为20.34％、15.25％、11.86％;相对于荧光PCR,常规PCR的灵敏度和特异度分别为75％、100％,细胞培养的灵敏度和特异度分别为56％、99.39％;与常规PCR相比,细胞培养的灵敏度为75％,特异度为99.43％.结论 3种方法在灵敏度方面相差很大,但在特异性上几乎没有差异.由于荧光PCR和常规PCR具有很高的灵敏度,并且检测速度快,适用于暴发疫情的应急诊断;细胞培养作为一种经典的病原学检测方法,可以获得流感毒株,用来开展抗原性、基因特性和耐药性等深入研究.
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Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较
目的 比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法.方法 应用TaqMan 探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htpAB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价.结果 TaqMan PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍.重复性测试TaqMan法Ct变异系数CV:0.2％～3.0％,SYBR Green法的CV:0.3％～6.0％.TaqMan和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h.四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性.结论 TaqMan探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断.
关键词： Q热立克次体 Q热 Real-time PCR 常规PCR 评价
