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If电流
心脏窦房结的自律性起搏细胞的电生理特征与普通心肌细胞截然不同,有起搏功能的细胞在一次动作电位结束后,其跨膜动作电位并不停止在静息膜电位水平,而是发生逐渐的舒张期自动化极化,当跨膜电位达到阈值时将形成一次新的除极.新研究结果证实,这是起搏Ir电流作用的结果.
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HCN通道的研究进展
HCN通道广泛存在于心脏、脑、胃肠等组织器官的细胞膜上,在哺乳动物细胞中仅含有4种HCN通道亚型(HCN1～HCN4).cAMP通过直接与HCN通道的CNBD结合来调节通道的活动状态,由其产生的Ih电流发挥相应的生物学功能.研究发现心脏、大脑等重要器官组织缺血缺氧,造成细胞受损,引起细胞膜上的HCN通道功能改变,随之产生相应的心律失常、大脑血管神经障碍等疾病.在分子生物学基础上,对HCN通道的研究,将为阐明常见心律失常及脑神经疾病发生发展的机制提供有力证据,为防治其并发症提供有效途径.
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高糖环境对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞内向电流的影响
目的 观察高糖环境对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞(ICCs)内向电流的影响.方法 采用胶原酶消化法,得到原代培养的成年豚鼠膀胱ICCs；采用膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录葡萄糖5(对照组)、15(高糖Ⅰ组)、30 mmol/L(高糖Ⅱ组)下ICCs超极化激活时的内向电流值.结果 正常对照组膀胱ICCs的内向电流值为(505.75±157.660)pA,高糖Ⅰ组为(349.25±71.087) pA,高糖Ⅱ组为(95.00±33.337)pA.三组间比较,P均＜0.01.结论 高糖环境可导致豚鼠膀胱ICCs超极化激活的内向电流值降低,这可能是导致糖尿病膀胱病变的原因之一.
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急性缺血对单个窦房结起搏细胞起搏电流的影响
目的 探讨急性缺血对窦房结起搏细胞起搏电流(If)影响的机制.方法 将兔窦房结起搏细胞分为三组,均先灌流正常台式液,电流稳定后实验Ⅰ、Ⅱ组分别灌流含5.4、10mmol/L KCl的缺血样台式液,实验Ⅲ组灌流含10mmol/L KCl台式液,灌流5～8min,再用正常台式液冲洗;采用穿孔膜片钳技术记录If.结果 实验Ⅰ组If电流密度在舒张期膜电位(-60～-70mV)无显著变化;实验Ⅱ组If电流密度在测试电位(-60～-110mV)均显著增强(P<0.05);而实验Ⅲ组If电流密度亦显著增强(P<0.05).结论 急性缺血伴有细胞外高钾可显著增强兔窦房结起搏细胞If电流密度,其机制可能与细胞外高钾有关.
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体外诱导心肌样细胞中HCN4过表达对起搏电流特性的影响
目的 体外构建具有表达功能性的起搏心肌样细胞,并检测起搏心肌样细胞中起搏电流的特性.方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞.构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体(rAd/GFP/HCN4)和绿色荧光蛋白的腺病毒载体(rAd/GFP),转染至心肌样细胞分为rAd/GFP/HCN4组和rAd/GFP组,不做任何处理作为对照组.Western blot检测各组HCN4蛋白表达,全细胞膜片钳技术记录各组中起搏电流情况.结果 荧光显微镜观察到长梭形心肌样细胞,PCR鉴定重组腺病毒载体rAd/GFP/HCN4和rAd/GFP构建成功;rAd/GFP/HCN4组HCN4蛋白相对表达量(1.31±0.02)高于rAd/GFP组(0.55±0.02)和对照组(0.52±0.03) (P＜0.05),rAd/GFP组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);膜片钳实验在转基因细胞中检测到起搏电流,而rAd/GFP组和对照组中未检测到起搏电流.结论 rAd/GFP/HCN4转染到心肌样细胞中,心肌样细胞中HCN4蛋白表达增加且可检测到起搏电流,从而使心肌样细胞具有自主搏动,为体外构建生物起搏器提供研究基础.
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神经生长因子对原代培养Cajal间质细胞的营养作用
目的 研究神经生长因子(NGF)对体外培养Cajal间质细胞(ICC)的作用及对特征性起搏电流即自发节律性内向电流的影响.方法 取CD-1新生小鼠的空肠组织,采用精细快速剥离,取含有肌间丛及肌间丛Cajal间质细胞(ICC.AP)的纵行肌组织块进行培养.12h后加人50ng/mL神经生长因子,3-4 d后对照观察、并用膜片钳检测Cajal间质细胞的内向电流.结果 NGF对培养Cajal间质细胞的生长发育有明显的促进作用,表现为数量增加(每400倍视野细胞数量:NGF 26±8,对照组14±10)、分支增多和网状结构更致密.NGF对培养Cajal间质细胞所产生的自发节律性内向电流与对照组相比表现为电流波形成熟或完整、频率规则而持续、幅度高大而变均衡(电流幅度:NGF 179.3 pA±29 pA,对照组120.8 pA±64 pA).结论 NGF对于Cajal间质细胞的生长发育有明显的促进作用,对特征性起搏电流有加强和稳定作用.
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心脏K+电流的特点和功能
不同物种,心脏不同部位的不同组织,至少存在10种不同的K+电流.某些电流只在某种组织中存在,如IKACh电流只在心房中存在,起搏电流只在有起搏功能的细胞中存在.这些电流每一种都有其特定的激活时程(如存在失活过程的话,也有特定的失活过程)和从失活恢复的时间过程(如果存在的话),并常常取决于机能状态受到某些特异性阻滞剂的调节.正如利用这些电生理特性来确定在异源性表达系统中的电流和天然细胞中的电流有什么关系.近年来对多数心肌细胞K+电流的分子基础的研究已很充分[1].一组被称为延迟整流的K+电流是因为它们受到去极化脉冲并不立刻激活,而是有些延迟.已报道有3种延迟整流K+电流,即慢的激活的延迟整流K+电流(IKs)、快速激活的延迟整流K+电流(IKr)和超速激活的延迟整流K+电流(IKur).
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人参皂苷Rb1对培养的小鼠小肠Cajal细胞起搏电流影响的研究
目的 探讨人参皂苷Rb1对培养的小鼠小肠Cajal细胞起搏电流影响.方法 以9～12d的Balb/c小鼠小肠为组织来源,采用Ⅱ型胶原酶酶解法分离、培养细胞;对培养的ICC细胞,采用免疫细胞化学的方法,应用ICC特异的c-kit抗体进行免疫荧光染色后,用荧光显微镜对其进行鉴定;采用膜片钳技术来观察Rb1对培养的ICC细胞的起搏电流的影响.结果 特异性的c-kit蛋白抗体荧光染色鉴定成功培养出Balb/c小鼠肠道ICC;不同浓度的Rb1(5,10,50,100 μmol/L)对培养的ICC细胞的起搏电流无明显影响,无可重复性.结论 人参皂苷Rb1对培养的ICC起搏电流无明显影响.
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干细胞治疗缓慢型心律失常的研究进展
电子起搏器是临床上治疗心脏传导阻滞等缓慢型心律失常的主要的治疗方法,但是具有许多不足之处.目前有研究表明,胚胎干细胞和间充质干细胞可以通过诱导或者基因改造的方法,表达起搏电流,产生自发的起搏心律,用来治疗缓慢型心律失常,现就其研究进展作以下综述.
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心脏起搏电流抑制剂ivabradine的临床应用
近年来在心绞痛的治疗上虽然有进展,但与需要相比仍然不够,主要是因为有些药物的严重不良反应限制了在临床上的应用.因此与硝酸酯类药、β受体阻滞剂、钙拮抗剂等药物作用方式完全不同的新的更有效的药物--心脏起搏电流(If)抑制剂在近20年发展起来.
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mHCN2基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞内向电流的记录及检测
目的 构建超极化激活环的环核苷酸门控通道亚型2(mHCN2)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),采用膜片钳技术记录细胞的内向电流并检测其电生理特征.方法 采用密度梯度离心法和贴壁分离法分离获得mMSCs.EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pGH-mHCN2和pIRES2-EGFP,T4连接酶连接,构建质粒pIRES2-EGFP-mHCN2.脂质体将质粒转染至mMSCs,荧光显微镜下鉴定.全细胞膜片钳记录IHCN2并加入起搏电流特异性阻断剂Cs+检测其电流变化.结果 酶切鉴定及测序检测证明质粒pIRES2-EGFP-mHCN2构建成功.荧光显微镜下可见转染成功的mMSCs发出绿色荧光.膜片钳记录到转染mHCN2基因的mMSCs的电压依赖性内向电流,其半大激活电位为-95.1±0.9 mV,阈电位为-60 mV,大激活电位为-140 mV.电极外液中加Cs+,内向电流几乎被完全抑制.未转染mHCN2 的mMSCs未记录到内向电流. 结论 mHCN2基因在mMSCs中表达具有生理性起搏电流特征的电流,基因修饰的mMSCs有可能替代窦房结起搏细胞在自动除极过程中发挥重要作用.
关键词： 电生理学 间充质干细胞 超极化激活环核苷酸门控离子通道 膜片钳 起搏电流 -
哇巴因对乳鼠心室肌起搏电流的影响
目的 研究哇巴因对乳鼠心室肌起搏电流电生理特性的作用.方法 体外培养乳鼠心室肌细胞.一周之内,应用常规全细胞膜片钳技术检测1,20,40,80 μmol/L哇巴因对培养心室肌细胞起搏电流的电流密度、起搏阈值等的作用.结果 1 μmol/L的哇巴因即可明显增加起搏电流的电流密度(4.76±0.48 pA/pF vs 4.0±0.41 pA/pF,P＜0.01).随着哇巴因浓度进一步增加,起搏电流的电流密度逐渐增大,HCN通道的半大激活电位逐渐向去极化方向改变,电导曲线明显右移,活化速度也明显加快,尾电流被增强,但反转电位不受影响.结论 哇巴因对心室肌HCN通道可能有剂量依赖性的激活作用.
关键词： 电生理学 哇巴因 起搏电流 膜片钳全细胞记录技术 心室肌细胞 -
乳鼠心室肌起搏电流的特点及其基因的表达
目的 研究乳鼠心室肌细胞起搏电流(If)的特点,并运用实时定量聚合酶链式反应(PCR)分析乳鼠心室肌If基因的表达.方法 通过酶消化法分离乳鼠心室肌细胞,用光镜、透射电镜、免疫组化鉴定心肌细胞;用全细胞膜片钳技术记录If并研究其特性;采用SYBR-Green I染料进行实时定量PCR,测定乳鼠心室肌If基因即超极化激活的环核苷酸门控通道(mHCN)亚型2和mHCN4的表达.结果 光电显微镜下见搏动频率50～100次/分的细胞团;透射电镜看到丰富的线粒体、肌丝明显;用抗肌动蛋白α-actin的单克隆抗体鉴定心肌细胞,95%以上呈现阳性.全细胞膜片钳记录到心室肌细胞的If,并得到电流密度-电压曲线,其激活电压约为-75 mV;实时定量PCR检测mHCN2:mHCN4为(5.15±0.19):1.结论 乳鼠心室肌细胞有超极化激活、可被Cs+阻断的If,其基因表达以mHCN2为主.
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起搏通道基因亚型HCN4重组腺病毒载体的构建及通道电流检测
目的旨在构建超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)重组腺病毒载体并鉴定其离子通道功能.方法全长人HCN4基因酶切后亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,形成含目的基因和绿色荧光蛋白基因的穿梭载体.穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法在BJ5183大肠杆菌中同源重组,重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用脂质体介导转染到HEK293细胞进行病毒的包装和扩增.用多聚酶链反应(PCR)方法对病毒上清中的HCN4进行检测,并将重组腺病毒感染COS-7细胞,用免疫荧光染色检测HCN4蛋白质的表达,利用全细胞膜片钳方法测定转HCN4基因细胞的电生理功能.结果通过酶切、测序、PCR等证实HCN4通道基因重组腺病毒载体构建正确,免疫荧光检测证实转染AdHCN4的COS-7细胞中HCN4通道基因的表达,膜片钳实验也在转基因细胞中检测到超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If).结论 HCN4通道基因重组腺病毒载体的构建成功为进一步研究该离子通道的电生理功能及在心律失常疾病基因治疗方面的潜在应用价值奠定了基础.
关键词： 分子生物学 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 起搏电流 腺病毒 -
伊伐布雷定在快速性心律失常中的应用
伊伐布雷定是一种特殊的起搏电流(If)抑制剂,可用于降低心率,并具有潜在的抗心律失常作用.伊伐布雷定能降低由If引起的细胞自律性以及抑制房室结的传导速度,具有潜在的预防与治疗心房颤动和控制心房颤动心室率的作用.伊伐布雷定抑制HCN通道和If,对室性心律失常有一定的治疗作用.伊伐布雷定可抑制窦房结内的If,降低窦房结节律,从而稳定心率.伊伐布雷定目前的治疗价值尚缺乏大规模临床研究的证据支持,还需进一步深入研究.
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缓慢性心律失常生物心脏起搏治疗的研究进展
生物心脏起搏主要通过基因疗法和细胞疗法建立生物心脏起搏、恢复传导系统的功能.其中基因疗法包括转基因法上调β2肾上腺素能受体、过度表达特异性的起搏电流和通过显性负突变,选择性地将内向整流性钾电流抑制在一定水平以下,恢复非起搏细胞潜在的起搏活性.而细胞疗法则通过对胚胎干细胞、骨髓间质干细胞等进行诱导分化成一些细胞株,以及在体外通过基因修饰这些可移植的细胞(成纤维细胞、不同的干细胞衍生的细胞或其他细胞)而展示具体的电生理特征,然后移植到活体心脏,以治疗缓慢性心律失常.
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心脏起搏电流及其抑制剂的研究进展
心脏起搏电流在激发和调节起搏性活动方面起着重要的作用.其特异性抑制剂Alinidine、Zatebradine、Cilobradine、ZD-7288及Ivabradine可减慢心率,又无变力作用方面的影响,是应用于临床的潜在药物.
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伊伐布雷定在快速性心律失常治疗中的研究进展
伊伐布雷定是一种新型减慢心率药物,对快速性心律失常有潜在的治疗作用.伊伐布雷定特异性地抑制起搏电流(If),降低窦房结节律,对不适当窦性心动过速及体位性心动过速综合征的治疗有一定的作用.伊伐布雷定能降低心肌细胞自发动作电位的频率,减慢房室结的传导速度,可能减少心房颤动的发生并且控制心室率,其临床疗效观察存在不一致性,其疗效有待观察.伊伐布雷定通过抑制超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)通道介导的If增加,其可能减少室性心律失常的发生率,降低心室颤动阈值,其临床疗效有待验证.
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细胞兴奋:从起搏电流到超极化激活的环核苷酸门控通道
心脏传导组织特定心肌细胞的起搏点功能就在于这些细胞可以产生舒张期自动去极化.在动作电位(AP)结束时,起搏点去极化可使膜电位逐渐增高接近新AP启动的阈值,因而产生周而复始的电活动.起搏点去极化的离子机制是一种超极化激活的电流If.这种电流首次在兔窦房结(SAN)上描述时曾被称做"特种电流(funny current, If; 或queer current, IQ)",现在也称做超极化激活的阳离子电流(hyperpolarization-activated cation current, Ih),原因是它有几种不同寻常的特点,包括超极化激活、钾钠离子通透、胞内cAMP调节及微弱的单通道电导等[1,2].在心脏和神经原细胞,该通道控制自主活动和兴奋性.近超极化激活的环核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)亚单位的克隆为理解If 通道特性提供了分子基础.笔者将就该领域的新进展做一综述.
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mHCN2基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞用于构建生物起搏器的基础研究
目的 构建起搏基因质粒pIRES2-EGFP-mHCN2并转染到大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),检测其在MSCs中核酸和蛋白水平是否表达.方法 采用密度梯度离心法分离获得MSCs.EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切质粒pGH-mH-CN2和pIRES2-EGFP,回收目的 片段,T4DNA连接酶连接.转化筛选阳性菌落,酶切和测序鉴定mHCN2是否插入pIRES2-EGFP中.脂质体转染质粒pIRES2-EGFP-mHCN2至MSCs,荧光显微镜下鉴定,并采用RT-PCR方法和Western blot方法分别检测转染质粒pIRES2-EGFP-mHCN2对mHCN2 mRNA和蛋白表达的影响.结果 酶切鉴定和测序结果均证明mHCN2片段插入质粒plRES2一EGFP.荧光显微镜下可见转染了质粒的MSCs发出绿色荧光.已转染质粒MSCs的mHCN2 mRNA的平均相对表达量是未转染MSCs的5.31倍(P<0.05),mHCN2蛋白是未转染MSCs的7.55倍(P<0.05).结论 成功构建质粒pIRES2-EGFP-mHCN2,证明了目的 基因mHCN2在MSCs中mR-NA和蛋白均有表达,为进一步研究生物起搏器奠定了基础.
