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mHCN2基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞内向电流的记录及检测
目的 构建超极化激活环的环核苷酸门控通道亚型2(mHCN2)基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),采用膜片钳技术记录细胞的内向电流并检测其电生理特征.方法 采用密度梯度离心法和贴壁分离法分离获得mMSCs.EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pGH-mHCN2和pIRES2-EGFP,T4连接酶连接,构建质粒pIRES2-EGFP-mHCN2.脂质体将质粒转染至mMSCs,荧光显微镜下鉴定.全细胞膜片钳记录IHCN2并加入起搏电流特异性阻断剂Cs+检测其电流变化.结果 酶切鉴定及测序检测证明质粒pIRES2-EGFP-mHCN2构建成功.荧光显微镜下可见转染成功的mMSCs发出绿色荧光.膜片钳记录到转染mHCN2基因的mMSCs的电压依赖性内向电流,其半大激活电位为-95.1±0.9 mV,阈电位为-60 mV,大激活电位为-140 mV.电极外液中加Cs+,内向电流几乎被完全抑制.未转染mHCN2 的mMSCs未记录到内向电流. 结论 mHCN2基因在mMSCs中表达具有生理性起搏电流特征的电流,基因修饰的mMSCs有可能替代窦房结起搏细胞在自动除极过程中发挥重要作用.
关键词： 电生理学 间充质干细胞 超极化激活环核苷酸门控离子通道 膜片钳 起搏电流 -
甲苯噻嗪通过抑制超极化激活环核苷酸门控离子通道电流产生镇痛作用机制研究
目的 探讨甲苯噻嗪(xylazine,Xyl)通过抑制超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)电流产生镇痛作用的机制.方法 对HCN亚型通道1(HCN1)基因敲除小鼠(HCN1-/-)及HCN1野生型小鼠(HCN1+/+)分别腹腔注射生理盐水及Xyl(10、20、30和40 mg/kg),通过进行机械痛觉测试及甩尾试验方法检测Xyl的镇痛效果,计算出大镇痛效应百分比(percentmaximum possible effect,％MPE);HEK 293细胞转染HCN1质粒和HCN亚型通道2(HCN2)质粒,分为对照组及不同浓度Xyl(12.5、25、50和100 μmol/L)实验组,利用全细胞膜片钳记录表达HCN1和HCN2离子通道的HEK 293细胞超极化激活电流(hyperpolarization-activated currents,Ih),计算Xyl对Ih的抑制率.结果 HCN1+/+小鼠和HCN1-/-小鼠注射Xyl后对机械痛觉刺激和热辐射刺激反应的％MPE均为随着Xyl质量浓度增加而加大,当Xyl质量浓度为30mg/kg及40 mg/kg时,HCN1-/-小鼠机械痛觉刺激测试的％ MPE为(62.06±14.72)％和(69.92±16.09)％;甩尾试验％MPE为(52.50±1.97)％和(64.74±6.34)％.HCN1+/+小鼠机械痛觉刺激测试的％ MPE为(75.47±8.06)％和(86.35±11.31)％;甩尾试验％MPE为(57.83±4.82)％和(74.98±9.35)％,等量Xyl对HCN1+/+小鼠与HCN1-/-小鼠的镇痛作用(机械痛觉刺激和甩尾试验)差异有统计学意义(P＜0.05).全细胞膜片钳试验结果显示,Xyl对HCN1及HCN2离子通道电流均产生了抑制作用,Xyl(12.5～100 μmol/L)对HCN1的Ih的抑制率为(24.62±23.62)％～(62.40±15.48)％;HCN1的半数激活电压(V1/2)为:(-79.58±1.56)mV～(-98.95±3.57)mV.Xyl对HCN2的Ih的抑制率为(29.19±17.82)％～(80.02±6.64)％;HCN2的V1/2为:(-102.17±1.36)mV～(-117.48±2.38)mV.结论 Xyl对HCN1+/+小鼠的镇痛效果比HCN1-/-小鼠更好.Xyl可能是通过抑制HCN离子通道电流,从而产生镇痛作用.
