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建立稳定抑制死亡相关蛋白激酶表达的细胞系
目的 筛选稳定抑制DAPK表达的PC12细胞系,并观察这些细胞系的生长特性.方法 设计、合成4条RNA干扰序列,连接到pDsRed1-N1-U6质粒载体上,扩增后提取质粒转染到PC12细胞,并同时转染1株空载质粒作为对照,然后通过G418筛选细胞克隆,建立稳定增殖细胞系,再通过Western blot筛选为有效的干扰序列,后用MTT、流式细胞术等检测转染细胞系的生长特性.结果 4条干扰序列均已成功转染并筛选出单克隆细胞系,Westem blot实验结果证实,4条干扰序列中有3条对DAPK的表达有明显的抑制作用,其中以第2条干扰序列的抑制效果为明显.结论 成功建立稳定增殖和抑制DAPK表达的细胞系.
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DAPK蛋白C-末端多肽对TNF-α抑制人胚肺成纤维细胞生长的影响
目的 研究死亡相关蛋白激酶(DAPK)C-末端多肽对TNF-α抑制人胚肺成纤维细胞生长的影响,为在应用α肿瘤坏死因子(TNF-α)治疗疾病时,将DAPK蛋白C-末端多肽(DCTP)用于保护正常组织细胞提供实验证据.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-DCTP,并采用脂质体法将其转入体外培养的人胚肺成纤维细胞,RT-PCR、Western blotting检测DAPK蛋白C-末端多肽表达,MTT法检测人胚肺成纤维细胞生长.结果 真核表达载体pcDNA3.1(+)-DCTP在人胚肺成纤维细胞中获有效表达.pcDNA3.1(+)-DCTP对细胞增殖无影响,但DAPK蛋白C-末端多肽可抑制TNF-α的细胞毒性.结论 DAPK蛋白C-末端多肽抑制TNF-α对人胚肺成纤维细胞生长的抑制,为在应用TNF-α治疗疾病时,将DAPK蛋白C-末端多肽用于保护正常组织细胞的临床研究提供了前提基础.
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DAPK mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达及意义
目的:探讨河南省食管癌高发区居民食管鳞癌组织中DAPK mRNA和蛋白的表达特征及意义.方法:应用原位杂交和免疫组织化学法检测50例食管鳞癌组织、17例癌旁不典型增生组织及20例正常食管黏膜组织中DAPK mRNA和蛋白的表达,并分析DAPK表达与临床病理特征的关系.结果:在食管鳞癌癌变过程中DAPK在正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及癌组织中mRNA及蛋白的表达组间比较有明显差异(X2 =14.655,7.998,均P<0.05);不同TNM分级及有无淋巴结转移的食管鳞癌组织之间DAPKmRNA及蛋白表达差异均有统计学意义(均P<0.05).DAPK mRNA及蛋白食管鳞癌组织中的表达呈正相关关系(γ=0.743,P=0.000).结论:食管鳞癌组织中DAPK mRNA与蛋白表达均降低,其表达降低或者缺失可能与食管鳞癌发生发展有关;检测DAPK mRNA及蛋白的表达有望成为食管鳞癌早期诊断和判断预后的分子指标之一.
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死亡相关蛋白激酶在肝细胞癌中的表达及其临床意义
目的 研究死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase, DAPK)在原发性肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其与HCC临床病理特征的关系. 方法 应用免疫组织化学SP法检测DAPK在50例HCC组织及其癌旁组织和5例正常肝脏组织中的表达. 结果 DAPK在HCC组织中的阳性率为36%,明显低于癌旁组织62%及正常肝组织100%(P < 0.05);DAPK低表达与HCC组织分化程度淋巴结转移有关(P < 0.05). 结论 DAPK表达下调在HCC的发生发展中可能起重要作用.
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DAPK在肿瘤中的研究进展
死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)是钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在整个凋亡系统中发挥着重要作用,是凋亡正性调节因子之一.DAPK被认为是抑癌基因,与肿瘤的发生、发展、转移密切联系,在肿瘤早期诊断、评价预后及基因靶向治疗等方面有重要意义.
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死亡相关蛋白激酶与肿瘤
死亡相关蛋白激酶(DAPK)是钙离子/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸激酶.DAPK有一个多区结构,具有潜在的转录活性,色氨酸308自身磷酸化被认为是其基本状态的一个自控装置.DAPK参与干扰素-γ、TNF-α、p53和TGF-β等介导的细胞凋亡,在整个凋亡系统中发挥着重要作用.DAPK被认为是抑癌基因,与肿瘤的发生、发展、转移密切联系,其启动子CpG岛甲基化是其在表观遗传学上调节的重要方式.DAPK在肿瘤早期诊断、评价预后及基因靶向治疗等方面有重要意义.
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DAPK基因甲基化与肿瘤相关性的研究进展
死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因启动子区域高甲基化可使其表达沉默，从而抑制细胞凋亡，诱导肿瘤的发生和转移。在不同肿瘤类型或关于同一类肿瘤的不同报道中，DAPK基因甲基化数据相差很大。此外，大多数DAPK基因甲基化研究缺乏相应mRNA或蛋白表达数据。因此，规范DAPK甲基化及表达检测手段，明确其作用机制，对肿瘤中的DAPK研究至关重要。
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乌苯美司对大肠癌细胞增殖与凋亡影响及其机制探讨
目的:观察乌苯美司对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响,并探讨其可能作用机制.方法:分别用低、中、高浓度乌苯美司(1.0、4.0和8.0 μmol/L)处理大肠癌细胞,应用CCK-8检测处理前后细胞增殖情况;应用流式细胞仪检测处理前后大肠癌细胞生长周期及凋亡状态;应用MSP检测处理前后DAPK基因启动子甲基化状态,RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因表达的改变.结果:正常大肠癌细胞表现为对数增殖状态,低浓度乌苯美司处理后的大肠癌细胞增殖率为61.23％,中浓度为20.25％,高浓度为7.97％,细胞增殖速度与乌苯美司浓度呈负相关;并且经乌苯美司处理后的大肠癌细胞传代5、10和15代的增殖速度均低于正常未处理细胞.对照组大肠癌细胞吸光度值为0.554 2±0.01,低浓度组为0.359 4±0.217,中浓度组为0.153 4±0.013,高浓度组为0.091 8±0.004,吸光度值组间差异有统计学意义,P＜0.001;各组与对照组相比差异亦有统计学意义,P＜0.001.而细胞凋亡率依次增高,正常组大肠癌细胞凋亡率为1.53％,低浓度组为24.33％,中浓度组为35.74％,高浓度组为46.27％,差异有统计学意义,F=9.18,P=0.025.正常大肠癌细胞DAPK基因启动子呈甲基化状态,mRNA和蛋白质表达缺失,经低、中、高浓度乌苯美司处理后,DAPK基因启动子被逆转成去甲基化状态,mRNA和蛋白质恢复表达,表达量与乌苯美司浓度正相关,处理的大肠癌细胞传代后仍可检测到DAPK基因mRNA表达.结论:乌苯美司可抑制大肠癌细胞增殖,并促进其凋亡,其作用机制可能与调整DAPK基因启动子甲基化状态有关.
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维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中死亡相关蛋白激酶启动子甲基化水平的研究
目的 了解维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织的死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子甲基化水平,探讨DAPK基因启动子甲基化与宫颈病变程度之间的关系.方法 选取维吾尔族妇女的正常或炎症宫颈组织(对照组)、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级、CINⅡ～Ⅲ级及宫颈鳞癌组织标本各30例,运用甲基化特异性聚合酶链反应检测其DAPK启动子甲基化水平,运用免疫组化SP法检测其DAPK蛋白表达水平.结果 对照组、CIN Ⅰ组、CINⅡ～Ⅲ组和宫颈癌组DAPK基因的甲基化率分别为3.3％、10.0％、36.7％和63.3％,宫颈癌组显著高于其他各组(均P＜0.05).DAPK基因的甲基化水平与宫颈病变程度呈正相关.对照组、CIN Ⅰ组、CINⅡ～Ⅲ组和宫颈癌组DAPK蛋白表达的阳性率分别为93.3％、83.3％、60.0％和33.3％,宫颈癌组显著低于其他各组(均P＜0.05).DAPK蛋白表达水平与宫颈病变程度呈负相关(rs=-0.603,P＜0.001).结论 DAPK基因启动子甲基化参与了宫颈癌的发生,并在宫颈癌发展的早期就已出现,可为宫颈癌的早期诊断提供依据,而DAPK蛋白表达随着宫颈病变进展降低,甚至消失.
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死亡相关蛋白激酶基因启动子区过甲基化与喉癌的关系
目的探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子区过甲基化与喉癌的关系.方法采用MSP和RT-PCR法分析喉部正常黏膜、喉癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况.结果 58例喉癌组织中,有39(67.2%)例DAPK基因启动子区过甲基化,其在各病理分级和T分级之间差异无显著性(P>0.05),而在N分级(N0和N1)之间差异有显著性(P<0.001).58例癌旁组织中,有6例甲基化,且均为喉癌组织中有甲基化的病例.RT-PCR结果显示,所有甲基化的喉癌组织中均无DAPK mRNA表达,而喉部正常组织、非甲基化的喉癌组织和癌旁组织中均有其表达.结论喉癌中DAPK基因启动子区过甲基化与其mRNA失表达有关,可能是喉癌发生、发展的原因之一,可作为喉癌诊断和预后分析的检测指标.
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地西他滨联合丙戊酸钠诱导的骨髓瘤细胞凋亡及其机制研究
目的 探讨地西他滨(DCA)联合丙戊酸钠(VPA)体外诱导骨髓瘤细胞株RPMI 8226凋亡及对死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因去甲基化的作用.方法 体外培养多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞,实验分为5组:DCA组(选取1.5、3μmol/L 2个浓度),VPA组(选取1、2μmol/L 2个浓度),DCA+VPA组(DCA 3μ mol/L+VPA 2μmol/L),PBS组,阴性对照组.上述细胞分别培养24、72h后,MTT法检测细胞存活情况.培养72h后,透射电镜观察DCA+VPA组细胞凋亡形态；流式细胞仪Annexin V法检测上述5组细胞凋亡率；MSP法检测上述5组细胞(DCA组取3μmol/L浓度,VPA组取2μmol/L浓度)处理前后DAPK基因甲基化状态,半定量RT-PCR方法检测DAPK基因表达情况.结果 处理72h后,DCA+VPA组MTT值下降明显,细胞存活率降低,与PBS组及阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；VPA组及DCA组MTT值均下降,DCA 3μmol/L组与PBS组及阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).处理72h后,DCA+VPA、VPA、DCA组G1/G0期细胞增多,S期细胞减少,细胞凋亡率增加,DCA+VPA组凋亡率高于DCA组及VPA组(P＜0.05),与PBS组及阴性对照组比较差异亦有统计学意义(P＜0.05).透射电镜下可观察到DCA+VPA组细胞出现核染色质凝聚、固缩、边集、核碎裂等典型的细胞凋亡形态学改变.处理72h后,DCA+VPA、VPA、DCA组细胞DAPK启动子均有去甲基化表现,以DCA+VPA组去甲基化程度为大,与PBS组及阴性对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).DCA+VPA、VPA、DCA组DAPK基因mRNA表达量均增加,且DCA+VPA组的相对mRNA比值高于其余4组(P＜0.05).结论 DCA联合VPA可诱导骨髓瘤细胞株RPMI 8226凋亡及DAPK基因启动子去甲基化,使DAPK基因表达恢复.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌细胞生长机制的研究
目的观察5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系生长增殖的影响,探讨其抗肿瘤效应及可能的机制.方法用5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系处理后,甲基化特异性PCR(MSP),T-A克隆测序分析死亡相关蛋白激酶(death-associ-ated protein kinase,DAPK)基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPKmRNA和蛋白的表达情况及细胞凋亡和周期的变化.结果未经5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞中DAPK基因CpG岛甲基化,且DAPKmRNA不表达.经5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,大于或等于10-7mol·L-1组的细胞中有DAPK mRNA表达,且表达随浓度增高而增强.免疫细胞化学染色显示,经处理后的肿瘤细胞DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达.流式分析结果为处理后凋亡率明显增加,且G1期细胞增加,G2/M期减少.结论5-杂氮-2'-脱氧胞苷能抑制喉癌细胞的生长和增殖,可能的机制是其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因的重新表达.
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丙戊酸钠对骨髓瘤细胞DAP-K基因去甲基化及迁移、侵袭力影响的实验研究
目的 本研究探讨丙戊酸钠(valproic acid sodium,VPA)体外对骨髓瘤RPMI 8226细胞株死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAP-K)基因去甲基化的作用及对其迁移、侵袭力的影响.方法 丙戊酸钠组(1、2、4μmol/L)、PBS组、阴性对照组作用RPMI 8226细胞株24、72h后进行试验,MSP法检测各组骨髓瘤细胞处理前后DAP-K基因甲基化状态,半定量RT-PCR方法检测DAP-K基因表达,transwell迁移及matrigel侵袭试验分别检测丙戊酸钠对RPMI 8226细胞迁移及侵袭能力的影响,并对VPA处理后细胞DAP-K基因表达情况及其迁移及侵袭能力行相关性分析.结果 ①丙戊酸钠组2、4μmol/L在VPA作用72h后RPMI 8226细胞其DAP-K启动子有去甲基化表现；②丙戊酸钠组2、4μ.mol/L在VPA作用72h后DAP-K基因mRNA表达量增加；③2、4μmol/L丙戊酸钠处理后RPMI 8226细胞迁移能力及侵袭力较PBS组及阴性对照组降低,有统计学差异(P＜0.05)；④VPA处理后RPMI 8226细胞DAP-K基因表达情况及其迁移及侵袭能力呈负相关.结论 丙戊酸钠可诱导骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞DAP-K基因启动子去甲基化,使DAP-K基因重新表达,并使迁移能力及侵袭力下降；VPA处理后RPMI 8226细胞DAP-K基因表达情况与其迁移与侵袭能力呈负相关.
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死亡相关蛋白激酶与肿瘤的诊断及治疗
死亡相关蛋白激酶(DAPK)是一种凋亡的正性调节因子,可促进肿瘤细胞的分化并抑制肿瘤的转移,被认为是肿瘤的抑制剂.DAPK基因启动子超甲基化或蛋白表达异常在多种肿瘤中均可观察到,并与分级分期及预后呈一定相关,表明其在肿瘤的发生及进展中发挥一定作用,在肿瘤的早期诊断、评价预后及基因靶向治疗等方面有重要意义.现就DAPK与肿瘤的诊断与治疗的研究进展予以一综述.
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌细胞株BGC803生长及死亡相关蛋白激酶基因表达的影响
目的：探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人胃癌细胞BGC803增殖、凋亡及对死亡相关蛋白激酶(DAPK)mRNA表达水平的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理BGC803细胞，设立不含5-Aza-CdR的对照组及3个实验组：5-Aza-CdR 1μmol/L组、5-Aza-CdR 5μmol/L组、5-Aza-CdR 10μmol/L组。CCK-8检测细胞的增殖情况，AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测药物处理后细胞凋亡的情况，RT-PCR检测用药前后DAPK mRNA的表达水平变化。结果实验组BGC803细胞增殖速度显著低于对照组，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。RT-PCR结果显示，BGC803细胞中DAPK基本无表达，5-Aza-CdR处理后，细胞中DAPK mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)。结论5-Aza-CdR抑制BGC803细胞增殖，并促进细胞凋亡，可能与其诱导DAPK基因表达有关。
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 死亡相关蛋白激酶 胃癌 细胞增殖 细胞凋亡 -
调节神经元凋亡信号转导途径的关键酶:死亡相关蛋白激酶
细胞的信号转导系统控制着包括细胞凋亡在内的细胞内几乎所有的生命活动.
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丙泊酚对大鼠脑创伤后神经细胞死亡相关蛋白激酶mRNA表达及凋亡的影响
死亡相关蛋白激酶(DAPK)[1]可出现于脑缺血和创伤性脑损伤后神经细胞凋亡启动阶段信号转导级联反应定型之前,其基因表达与多种促凋亡信号转导的生物分子作用有关[2-3].已证实丙泊酚具有脑保护作用,其作用机制还未完全阐明.
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死亡相关蛋白激酶与妇科肿瘤的研究进展
死亡相关蛋白激酶(death sssociated protein kinase,DAPK)是一种新的钙离子/钙调蛋白调节的丝/苏氨酸激酶,其广泛参与多种途径介导的细胞凋亡,被认为是肿瘤的抑制剂,与肿瘤细胞的分化转移有关.死亡相关蛋白激酶甲基化及其表达下调与多种肿瘤有关.介绍死亡相关蛋白激酶参与凋亡的机制,死亡相关蛋白激酶甲基化与妇科肿瘤发生、发展的关系及去甲基化治疗的应用前景.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨
目的:探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点.方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线.用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase DAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化.结果:5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P＞0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P＞0.01).在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达.结论:5-杂氮-2'-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长.
关键词： Hep-2细胞系 5-杂氮-2'-脱氧胞苷 裸鼠模型 死亡相关蛋白激酶 -
口腔鳞状细胞癌组织中死亡相关蛋白激酶的甲基化及其蛋白的表达
目的:探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因的表达、甲基化状态及与口腔鳞状细胞癌(oScC)的关系,为研究DAPK基因在OSCC组织中表达改变的机制及肿瘤基因治疗方法打下基础.方法:采用甲基特异性PCR和免疫组织化学方法分别检测23例正常口腔黏膜组织和53例OSCC组织中DAPK基因甲基化率、DAPK蛋白表达率.结果:23例正常口腔黏膜组织中无一例检测到DAPK基因启动子区甲基化,53例OSCC患者30例(56.60%)口腔黏膜组织中DAPK基因启动子区完全甲基化,8例(15.09%)DAPK基因部分甲基化,总甲基化率为71.69%(38/53),与正常口腔黏膜组织甲基化率比较差异有显著性(P<0.01).在23例(100%)正常口腔黏膜组织中DAPK蛋白表达均呈阳性,53例OSCC患者中36例(67.92%)口腔黏膜组织中DAPK蛋白表达下调,二者比较差异具有显著性(P<0.01);OSCC患者口腔黏膜组织中DAPK蛋白低表达组DAPK基因甲基化率(32/36,88.89%)高于正常表达组(6/17,35.29%)(P<0.01).结论:DAPK基因启动子区甲基化是该基因在OSCC组织中表达降低的机制之一,DAPK基因甲基化引起的基因功能静默可能与OSCC的发生有关.
