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乙醛脱氢酶1作为喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞标志物的实验研究
目的 探讨乙醛脱氢酶1(ALDH1)在人喉癌Hep-2细胞系中的表达,观察ALDH1高表达细胞的体外生长特性,确定喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞标志物.方法 采用荧光细胞化学染色和流式细胞术观察和检测喉癌Hep-2细胞系中的ALDH1的表达.采用流式分选术分离ALDH1高表达细胞,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察ALDH1不同亚群细胞的体外增殖能力,以流式细胞术检测ALDH1高表达细胞的体外分化能力.采用裸鼠成瘤实验比较不同亚群细胞的成瘤能力.结果 喉癌Hep-2细胞系中ALDH1呈不同程度的表达,其中ALDH1高表达细胞占2.9％±0.6％.ALDH1高表达细胞的体外增殖能力高于ALDH1低表达和未分选细胞.在含血清的培养液中,经过6d培养,ALDH1高表达细胞由初分选后的94.2％±3.8％下降至分选前水平.ALDH1高表达细胞的成瘤能力显著高于其他亚群.结论 喉癌Hep-2细胞系中,ALDH1高表达细胞具有很强的体外分化能力、增殖能力和成瘤能力,可以作为Hep-2细胞系肿瘤干细胞的标志物之一.
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丝裂霉素C诱导喉癌细胞凋亡及其对Bcl-2基因表达的影响
目的 探讨药物体外诱导喉癌细胞凋亡及其相关基因的作用.方法 丝裂霉素(MMC)处理喉癌细胞系Hep-2细胞,观察喉癌细胞的形态学改变,琼脂糖电泳检测DNA片断;免疫组化法检测Bcl-2基因表达.结果 2×10-2 g/L MMC作用24 h后,可见细胞浓缩,核固缩,染色质浓聚等;出现DNA ladder;12 h后,Bcl-2蛋白表达量明显增加.结论 MMC诱导喉癌细胞凋亡,MMC可能由于上调了Bcl-2蛋白的表达而减弱了自身对喉癌细胞的诱导凋亡.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌细胞生长机制的研究
目的观察5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系生长增殖的影响,探讨其抗肿瘤效应及可能的机制.方法用5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系处理后,甲基化特异性PCR(MSP),T-A克隆测序分析死亡相关蛋白激酶(death-associ-ated protein kinase,DAPK)基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPKmRNA和蛋白的表达情况及细胞凋亡和周期的变化.结果未经5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞中DAPK基因CpG岛甲基化,且DAPKmRNA不表达.经5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,大于或等于10-7mol·L-1组的细胞中有DAPK mRNA表达,且表达随浓度增高而增强.免疫细胞化学染色显示,经处理后的肿瘤细胞DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达.流式分析结果为处理后凋亡率明显增加,且G1期细胞增加,G2/M期减少.结论5-杂氮-2'-脱氧胞苷能抑制喉癌细胞的生长和增殖,可能的机制是其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因的重新表达.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨
目的:探讨5-杂氮-2'-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点.方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2'-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线.用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase DAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化.结果:5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P＞0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P＞0.01).在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达.结论:5-杂氮-2'-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长.
关键词： Hep-2细胞系 5-杂氮-2'-脱氧胞苷 裸鼠模型 死亡相关蛋白激酶 -
miR-152在声门上型喉癌中的表达及临床病理关系
目的 探讨并分析miR-152在声门上型喉癌组织中的表达情况,为进一步研究miR-152用于治疗靶向药物、评估预后提供参考依据.方法 采用Real-time PCR法检测83例患有声门上型喉癌患者癌组织中miR-152的表达,并将miR-152的表达数据与临床病理数据进行对比分析.后,通过MTT方法对比转染了miR-152模拟物组和阴性对照组的Hep-2细胞系受抑制情况.结果 miR-152在声门上型喉癌组织中显著低表达(t=12.65,P＜0.001),并且其低表达与声门上型喉癌的T分期(x2=26.88,P＜0.001)和N分期(z=-3.56,P＜0.001)相关.miR-152可抑制Hep-2细胞增殖.结论 miR-152可能作为声门上型喉癌预后的新靶点.
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高能X线诱导喉癌Hep-2细胞凋亡及相关基因的表达研究
目的:研究高能X线诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的作用及其分子机制.方法:采用不同剂量的高能X线作用于Hep-2细胞株,流式细胞仪检测其凋亡率.Western blot和RT-PCR方法检测细胞的BCL-2和BAX蛋白及mRNA转录水平.结果:在一定范围内,随着剂量的增加和时间的延长,细胞凋亡率基本呈增加趋势.Western blot和RT-PCR结果显示辐射后BCL-2表达下调,而BAX无明显改变,BCL-2/BAX的比值明显降低.结论:高能X线诱导的Hep-2细胞凋亡具有时间剂量依赖性.BCL-2和BAX参与了辐射诱导的Hep-2细胞凋亡,BCL-2抑制细胞凋亡可能是Hep-2细胞恶性增殖的主要原因之一.
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CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达
目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础.方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性.应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133).应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达.结果:PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段；酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体.荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达.结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达.
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人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系探讨
目的探讨人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系,以寻求能够预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物.方法体外长期传代的人喉鳞癌细胞系Hep-2经0、2、4、8、12Gy剂量照射3次后的存活后代体外培养20代,以克隆形成实验测定其放射敏感性参数SF2,用Southern-blotting法测定其端粒长度(TRF).结果体外长期传代的Hep-2细胞系随着受照剂量的增加, 其放射存活后代的SF2逐渐升高(P<0.05),其TRF逐渐缩短(P<0.01);而且,SF2与TRF呈现明显的正相关关系(r=0.921, P<0.01).结论通过不同放射剂量处理体外长期传代的人喉鳞癌细胞系可获得不同放射敏感性的细胞存活后代,且放射存活后代的放射敏感性与其细胞端粒长度具有较好的负相关关系,提示端粒长度检测有望成为预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物.
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巨噬细胞集落刺激因子对喉鳞状细胞癌喉癌细胞株的作用
目的:了解和探讨巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及其受体对喉鳞状细胞癌细胞株(Hep-2)细胞系的作用.方法:使用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)掺入法和MTT法测试M-CSF作用于Hep-2后细胞的增殖状况,并测试加入巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)抗体后细胞生长情况.ELISA法测试M-CSF作用Hep-2细胞后上清中的M-CSF的浓度变化.结果:Hep-2细胞培养后较培养前的上清中的M-CSF的浓度升高.加入的M-CSF浓度越大,细胞增殖越差,加入M-CSFR抗体浓度越大细胞增殖越好.结论:M-CSF对喉癌细胞Hep-2细胞的增殖具有抑制作用.
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人喉鳞癌细胞增殖及其放射敏感性异质性的实验研究
目的:探讨人喉鳞癌细胞增殖速度的异质性和放射敏感性的异质性.方法:体外长期传代的人喉鳞癌细胞系Hep-2经0、2、4、8、12Gy剂量前后照射3次的存活后代体外培养20代,测定其群体倍增时间(PDT)和放射敏感性参数SF2.结果:Hep-2细胞系相对高剂量(12Gy组)照射存活后代的PDT延长(P<0.05),相对低剂量(2、4、8Gy组)照射存活后代PDT无明显变化(P>0.05).Hep-2细胞系随着受照剂量的增加,其放射存活后代的SF2逐渐升高(P<0.05),且存活后代的SF2与PDT具有一定的正相关关系(r=0.798,P<0.01).结论:体外长期传代的Hep-2细胞系具有增殖速度和放射敏感性方面的异质性,且它们之间具有较好的对应关系.
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血卟啉衍生物光动力学疗法体外杀伤人喉癌细胞株Hep-2的实验研究
目的 探讨使用血卟啉衍生物对喉癌细胞进行光动力学治疗的有效照光时间和有效药物使用量.方法 使用波长630 nm的激光照射同血卟啉衍生物共同培养的喉癌Hep-2细胞株,使用MTT法评价不同的用药浓度(0、5、10、50、100和200μg/mL)和不同的光照能量密度(10、20、30、40和50J/cm2)细胞毒的作用.结果 随着药物浓度的增加细胞的死亡率增加,但是在100μg/mL以上增加不明显.随着光密度的增加细胞的死亡率增加,在40 J/cm2以后死亡率没有明显的增加.结论 血卟啉衍生物在630 nm的激光照射下能够有效地在体外杀伤肿瘤细胞,其杀伤的佳效果与用药浓度和照射能量有关.
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人喉鳞癌细胞端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性的关系
背景与目的:肿瘤细胞的端粒长度、端粒酶活性与其增殖能力和恶性程度关系密切,而且端粒和端粒酶还可能参与放射诱导的DNA损伤的修复;由此推测肿瘤细胞的端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性之间可能存在联系.本研究旨在探讨人喉鳞癌细胞端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性的关系.方法:体外长期传代的人喉鳞癌细胞系Hep-2经0、2、4、8、12Gy剂量照射3次后的存活后代体外培养20代,以克隆形成实验测定其放射敏感性参数SF2,Southern blot法测定其端粒长度(mean length of telomere restriction fragments,TRF),TRAP-ELISA法测定其端粒酶活性(telomerase activity,TA).结果:人喉鳞癌细胞不同放射剂量存活后代的SF2:0.47～0.64,TRF:3.76～9.43kb,TA:2.606～1.761,且它们各自的SF2、TRF、TA存在差异(P均＜0.05);而且,SF2与TRF呈现明显的正相关(r=0.921,P＜0.01),SF2与TA呈现明显的负相关(r=-0.929,P＜0.01),TRF与TA呈现明显的负相关(r=-0.944,P＜0.01).结论:人喉鳞癌细胞接受不同放射剂量存活后代的放射敏感性与其端粒长度和端粒酶活性具有一定的相关性,提示端粒长度与端粒酶活性检测对预测肿瘤细胞放射敏感性有一定意义.
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应用荧光原位杂交检测人喉癌中EGFR基因扩增
目的 检测人喉癌Hep-2细胞系和5例喉癌组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因扩增.方法 荧光原位杂交技术.结果 在Hep-2细胞系和2例喉癌组织中期染色体和间期细胞核中,检测到明显的集中成簇和多个斑点分散排布的杂交信号,另3例喉癌组织间期细胞核中杂交信号未见增强或数目增加.结论 以正常二倍体淋巴细胞染色体和间期细胞核为对照,在喉癌Hep-2细胞系和2例喉癌组织中期染色体和间期细胞核中存在不同程度EGFR基因扩增,扩增范围2～8倍,另3例喉癌组织细胞核中杂交信号强度和数目表明没有EGFR基因扩增.证实荧光原位杂交方法可应用于定量检测细胞系和癌组织中的基因扩增,而且可检测单一细胞中的基因扩增.
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血卟啉衍生物光动力学疗法体外杀伤人喉癌细胞株Hep-2的实验研究
目的：探讨使用血卟啉衍生物对喉癌细胞进行光动力学治疗的有效照光时间和有效药物使用量。方法：使用波长630nm的激光照射同血卟啉衍生物共同培养的喉癌Hcp-2细胞株，用MTT法评价不同的用药浓度(0μg．5μg、10μg、50μg、100μg、200μg／ml)和不同的光照能量密度(10J／cm2、20J／cm2、30J／cm2、40J／cm2、50J／cm2)细胞毒的作用。结果：随着药物浓度的增加细胞的死亡率增加，但是在50μs／ml以上增加不明显。随着光密度的增加细胞的死亡率增加，在40J／cm2以后死亡率没有明显的增加。结论：血卟啉衍生物在630nm的激光照射下能够有效的在体外杀伤肿瘤细胞，其杀伤的佳效果与用药浓度和照射能量有关。
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冈田酸对喉鳞癌细胞系PP2A活性及迁移的影响
目的:探讨冈田酸(0A)对喉鳞癌细胞系(Hep-2)活性和迁移能力的影响及其可能的作用机制.方法:采用四甲基噻唑蓝(MTT)比色实验确定OA作用于Hep-2的大浓度;酶活性实验检测不同浓度(0、50、100 nmol/L)OA对Hep-2蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的影响;划痕实验检测Hep-2在不同浓度(0、50、100 nmol/L)OA作用下迁移能力的变化.结果:50、100、200 nmol/L OA作用24h后Hep-2的相对活力分别为96.7％±1.8％、82.9％±12.6％和57.2％±7.7％,与对照组(100％)比较均明显下降(P均＜0.05).50和100 nmol/LOA作用24 h后PP2A的相对活性分别为30.90％±12.01％和8.98％±4.96％,与对照组(100％)相比明显下降(P＜0.05).划痕试验中,经OA作用24及48 h后Hep-2细胞的迁移能力与对照组相比均明显减弱(P＜0.05),并且100 nmol/L OA处理组迁移能力的减弱程度较50nmol/L OA处理组更明显(P＜0.05).结论:100 nmol/L冈田酸明显抑制Hep-2细胞PP2A活性并降低了细胞的迁移能力.
