首页 > 文献资料
-
mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立
目的 建立信使RNA(mRNA)电转抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)的方法,为制备基因修饰CDR3δ移植型yδ T淋巴细胞,为肿瘤细胞过继治疗提供新的技术方法.方法 以SpeⅠ内切酶消化重组pGEM4Z/EGFP/A64质粒,回收纯化线性化的重组质粒pGEM4Z/EGFP/A64,体外转录成mRNA;在电转参数为500 V500 μs 、400 V 500 μs或300 V 500μs等不同条件下,转染抗CD3抗体刺激的人PBMC;用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪观察和分析绿色荧光蛋白的表达;台盼蓝染色计算不同电转条件下细胞的存活率,以确定mRNA电转佳条件.结果 pGEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切,获得了线性化的质粒;体外转录得到了增强型绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA;与其他转染条件相比,在500 V 500 μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转后48 h绿色荧光蛋白表达量较高;与其他转染条件相比,在500 V 500μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转48 h后绿色荧光蛋白表达的阳性细胞高达77％;台盼蓝染色分析不同电转条件下细胞的存活率,在细胞电转48 h后,500 V 500 μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85％以上.结论 电转参数为500 v 500μs的条件可用于电转mRNA于抗CD3抗体扩增的人PBMC,以制备基因修饰T淋巴细胞.
-
建立以EGFP为报告基因检测HSV感染的细胞株
单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1, HSV-1)是人类病毒性疾病的常见病原体.建立简单实用的检测HSV-1感染的方法,对HSV-1感染疾病的诊断和治疗非常重要,也可作为抗病毒药物的开发筛药模型的指标.为此,我们建立以加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)为报告基因检测HSV感染的稳定转染细胞株,为今后的研究提供较为直观的手段.
-
人4型腺病毒绿色荧光蛋白报告载体的构建
目的 制备人4型腺病毒(Ad4)绿色荧光蛋白(EGFP)报告载体.方法 以我们前期制备的Ad4-GZ01株全基因组载体pBRAd4为基础,用常规分子克隆的方法将基因组E3区缺失并插入EGFP表达框,转染AD293细胞拯救得到重组病毒,测序、电泳和ELISA等方法鉴定,纯化病毒免疫小鼠,ELISA和细胞微量中和试验等方法检测其免疫原性.结果 成功获得携带EGFP报告基因的重组人4型腺病毒rAd4EGFP,其可以被Ad4特异性单抗及抗血清所识别和中和,免疫小鼠可以诱导抗Ad4抗体及抗EGFP特异性抗体.结论 成功制备人4型腺病毒绿色荧光蛋白报告载体,可用于疫苗研发、药物评价、转基因载体等研究.
-
Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其在C3H10T1/2中的表达
背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点.前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续.目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成.材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase.pCMV-Rennilla.反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供.方法:用多步亚克降技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescentprotein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并任常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路.主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H 10T1/2细胞的表达.②wnt7b诱导C3H 10T1/2碱性磷酸酶生成分析.③Wnt7b信号转导分析.结果:构建日的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸晦的生成.Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径.结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用.
-
人SLPI启动子调控下eGFP基因表达载体的构建与表达
目的构建SLPI基因启动子驱动下EGFP表达载体并验证该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控活性.方法通过PCR方法从人外周血基因组中扩增SLPI启动子,经序列分析后,利用pcDNA3.1(+)和pEGFP构建SLPI启动子调控下EGFP表达载体,以脂质体介导转染入人宫颈上皮癌Hela、肺腺癌A549、SPC-A1和肝细胞癌HepG2细胞中,经G418稳定筛选后,在荧光显微镜下观察该启动子在非小细胞肺癌细胞株中的特异调控EGFP表达的活性.结果克隆出的SLPI启动子序列与Genebank上SLPI基因上游5'末端转录调控区的序列完全一致,稳定转染的细胞株Hela、A549、SPC-A1和HepG2中,CMV启动子控制下的EGFP基因均有表达,发出绿色荧光;而SLPI启动子调控下的EGFP基因在Hela、A549和SPC-A1中有表达,发出绿色荧光,在HepG2中则未见荧光发出.结论 钓取的人SLPI启动子在非小细胞肺癌细胞中具有特异调控其下游基因表达的活性,为探索该启动子调控下的抗肺癌基因治疗提供实验基础.
关键词： 肺癌 分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因 启动子 基因治疗 加强型绿色荧光蛋白 -
CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达
目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础.方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性.应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133).应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达.结果:PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段；酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体.荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达.结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达.
-
含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达
目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体,观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况.方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-EGFP(pcBE),将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后,采用RT-PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况.结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白,同时显示绿色荧光.结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白,并以其荧光报告基因起示踪作用.
-
乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达
目的:构建pEGFP-X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达.方法:从质粒pcDNA3.1(+)-X酶切获HBV X基因片段,克隆至pEGFP-N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP-X载体;用脂质体法,将重组载体(pEGFP-X)和空载体(pEGFP-N1)瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT-PCR、荧光显微镜鉴定HBV X和EGFP基因表达.结果:鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBV X基因表达,并发绿色荧光.结论:构建的pEGFP-X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBV X基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBV X基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础.
