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转染NY-ESO-1特异性TCR增强人PBMC对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的特异性细胞毒性
目的 探讨体外转导NY-ESO-1特异性T细胞受体至人外周血淋巴细胞中,是否可增强转导后细胞体外特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力.方法 将NY-ESO-1特异性TCR质粒(pCDNA3.1-ESO-TCR)体外电转入新分离的正常人PBMC中,RT-PCR法鉴定转导是否成功；采用流式细胞仪分析转导后PBMC表型；用特异性NY-ESO-1b抗原肽(p157-165)刺激转导PBMC后,用ELISPOT法检测PBMC分泌IFN-γ的能力,用实时无标记动态细胞分析仪检测PBMC特异性细胞毒性作用.结果 电转后PBMC能够扩增出特异性TCR片段；电转pCDNA3.1-ESO-TCR质粒的PBMC细胞表面特异性TCR表达率高于电转空载体的PBMC的表达率(P＜0.05)；经多肽刺激后,电转目的质粒的PBMC分泌IFN-γ的斑点数明显多于电转空载体的PBMC(P ＜0.05)；转导后PBMC特异性细胞毒性作用明显强于电转空载体的PBMC.结论 经NY-ESO-1特异性TCR基因修饰的PBMC对NY-ESO-1阳性HepG2细胞的体外特异性杀伤作用有明显提高,为进行下一步肝癌过继性免疫研究提供了基础资料.
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mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立
目的 建立信使RNA(mRNA)电转抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)的方法,为制备基因修饰CDR3δ移植型yδ T淋巴细胞,为肿瘤细胞过继治疗提供新的技术方法.方法 以SpeⅠ内切酶消化重组pGEM4Z/EGFP/A64质粒,回收纯化线性化的重组质粒pGEM4Z/EGFP/A64,体外转录成mRNA;在电转参数为500 V500 μs 、400 V 500 μs或300 V 500μs等不同条件下,转染抗CD3抗体刺激的人PBMC;用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪观察和分析绿色荧光蛋白的表达;台盼蓝染色计算不同电转条件下细胞的存活率,以确定mRNA电转佳条件.结果 pGEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切,获得了线性化的质粒;体外转录得到了增强型绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA;与其他转染条件相比,在500 V 500 μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转后48 h绿色荧光蛋白表达量较高;与其他转染条件相比,在500 V 500μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转48 h后绿色荧光蛋白表达的阳性细胞高达77％;台盼蓝染色分析不同电转条件下细胞的存活率,在细胞电转48 h后,500 V 500 μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85％以上.结论 电转参数为500 v 500μs的条件可用于电转mRNA于抗CD3抗体扩增的人PBMC,以制备基因修饰T淋巴细胞.
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胎鼠子宫内电穿孔检测胎鼠脑生物学形态指标
该课题对胚胎期12.5、13.5、14.5d的C57/BL6孕鼠胎鼠以不同的电压参数进行子宫内电穿孔，分析比较不同电压对不同胚胎期胎鼠的存活率，从而总结出适应胚胎期12.5、13.5、14.5d胎鼠的优电转电压参数。结果显示，胚胎早期，电转所需要的电压相对小一些，同样胚胎早期的胎鼠的存活率低一些。在E14.5胎鼠脑室单侧电穿孔电转带有PCDF-EGFP质粒。该质粒表达绿色荧光蛋白（GFP）。进一步分析了电转后不同天数转染细胞的迁移程度，结果显示，在电转后2d，转染阳性的细胞主要分布在脑室和中间带，而在转染后3d，转染阳性细胞在脑室、中间带及皮层均有分布。继而对电转后的皮层厚度进行了分析，结果显示，电转皮层的厚度与未进行电转的皮层没有明显区别。该结果为子宫内电转在皮层发育中的应用提供了技术支持，并表明子宫内电转可以应用在皮层发育研究中。
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CKLF1高表达激活NF-κB信号通路导致小鼠肺部炎症
目的 有报道表明趋化素样因子1(CKLF1)在哮喘病人肺部高表达,但具体情况和机制尚不明确.本研究拟在动物水平考察CKLF1的致炎作用及相关机制.方法 将pCDB-CKLF1质粒或空载体pCDB电转入Balb/C小鼠体内,HE染色观察其肺部病理改变;硝酸酶还原法和ELISA法分别检测小鼠血清中NO和TNF-α的含量;提取小鼠肺部组织的胞质和胞核蛋白,蛋白免疫印迹实验考察胞质和胞核内NF-κB和IκBα表达的改变.结果 病理切片结果显示,转染pCDB-CKLF1质粒后,小鼠肺部出现明显的病理改变;小鼠血清中NO和TNF-α含量明显升高;胞质内NF-κB和IκBα表达明显减少,胞核内NF-κB和IκBα表达明显增加.结论 趋化因子CKLF1高表达能够导致动物肺部炎症的发生,CKLF1可能通过激活NF-κB 信号通路导致炎症.
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表达期特异性双荧光蛋白的转基因弓形虫的构建
目的 构建速殖子期特异表达绿色荧光和缓殖子期特异表达红色荧光的转基因弓形虫.方法 利用速殖子期特异性表达的SAG1基因启动子启动绿色荧光蛋白(EGFP)基因,利用缓殖子期特异性表达的BAG1基因启动子启动红色荧光蛋白( RFP)基因,构建期特异性表达双荧光的质粒,通过电转化将质粒转化进弓形虫体内进行表达.结果 经过息疟定抗性筛选得到阳性重组子,经荧光观察观察到了在速殖子时期表达的绿色荧光虫体和经缓殖子诱导后表达红色荧光的缓殖子虫体；通过PCR检测也检测到了EGFP和RFP基因.结论 本试验成功构建表达期特异性双荧光蛋白的转基因弓形虫.
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Western blot方法中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响
目的 研究Western blot方法 中不同电流强度对较大分子蛋白质转膜效率的影响.方法 利用(36~250)×103标志蛋白质,以8%SDS-PAGE凝胶分离,然后分别以100、200、300、400、500 mA恒流湿法电转2 h.结果 100、200 mA恒流2 h不能使250×103较大分子蛋白质全部转膜,凝胶有残留.300 mA以上则可使大部分或全部转膜,胶上未见残留.结论 电流强度对较大蛋白质转膜有影响.300~400 mA可作为250×103左右较大分子蛋白质从8%SDS-PAGE凝胶转膜的佳恒流强度.
