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人类新细胞因子(CKLF-1)在大肠杆菌中的表达与鉴定
目的进一步研究人类新细胞因子--趋化素样因子1(CKLF-1)蛋白的结构与生物学活性. 方法构建了融合蛋白的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行诱导表达,获得了原核表达的融合蛋白,经凝血酶切割获非融合重组蛋白,并进行体外活性鉴定. 结果 CKLF-1原核表达蛋白获得了高表达, 纯化后获得约90%纯度以上蛋白,发现其可以与肝素结合,生物学活性检测表明其对人中性粒细胞、外周血单个核细胞和大鼠的巨噬细胞具有明显的趋化作用. 结论 CKLF-1原核表达蛋白具有与真核表达蛋白类似的生物学活性.
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人重组趋化素样因子1在果蝇S2细胞中的表达和功能研究
目的 在果蝇S2细胞中表达人趋化素样因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1),并对其分泌形式进行功能研究.方法 构建pMT/V5-His-CKLF1表达质粒,转染S2细胞,筛选并鉴定阳性细胞克隆,用兔抗人CKLF1多肽抗体对其培养上清进行Western blot检测,并分析其趋化活性和促C2C12细胞增殖活性.结果 RT-PCR证明CKLF1在S2细胞中高效转录;通过Western blot在细胞培养上清中可检测到表达的重组CKLF1蛋白;其对人外周血中性粒细胞和淋巴细胞有较弱的趋化活性,对C2C12细胞具有增殖促进作用.结论 在果蝇S2细胞中成功表达了人重组CKLF1,并证实其存在分泌形式且具有趋化活性和促C2C12细胞增殖活性.
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趋化素样因子1研究进展
趋化因子家族是一类由免疫或非免疫细胞分泌的一级结构相似的小分子蛋白,在机体的免疫调节、过敏反应、炎症反应、细胞增殖分化等过程中发挥重要作用.趋化因子超家族成员具有一定的同源结构,根据一级结构中保守的4~6个Cys的前2个Cys的排列方式,可将趋化因子超家族分为CXC(α)、CC(β)、C(γ)和CX3C( )四个亚家族,它们的功能除趋化活性外,还具有细胞活化等多种生物学效应.这些趋化因子与七次跨膜的G蛋白偶联受体特异结合,通过G蛋白转导信号至细胞内,发挥其生物学活性.目前已发现28种CCL、16种CX-CL、2种CL和1种CX3CL.
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趋化素样因子1在大鼠主动脉损伤模型中的表达
目的 探讨趋化素样因子1在动脉内膜增生病变中的作用.方法 雄性SD大鼠85只,随机分组,损伤模型分为8组,每组10只,球囊损伤法建立腹主动脉球囊损伤模型,分别在术后12 h,1、3 d,1、2、4、6、8周取材.对照组5只,接受假手术.测量内膜面积/中膜面积评估术后内膜增生程度;免疫组织化学法检测CKLF1蛋白水平的表达,IPP6.0测定阳性染色平均光密度作为评价指标;RT-PCR检测趋化素样因子1(CKLF1)在mRNA水平的表达,以β-actin表达作为内参,CKLF1/β-actin比值作为CKLF1相对表达量.结果 术后1周可见明显新生内膜形成,至术后4周内膜面积/中膜面积升高明显,此后呈消退趋势,但仍明显高于术后1周及对照;免疫组化检测显示CKLF1在新生内膜表达强度高于中膜(P=0.016),新生内膜中CKLF1表达在术后1周较高;RT-PCR检测发现CKLF1表达在术后3 d出现高峰,逐渐减退,但仍高于基础水平(P<0.05);内膜增生程度与CKLF1相对表达量呈正相关(R=0.70),但无统计学意义(P=0.188).结论 动脉损伤后趋化素样因子1表达上调,新生内膜中表达强度明显高于中膜组织,推测趋化素样因子1对内膜增生的发展可能起一定作用.
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趋化素样因子1在血管再狭窄中的作用及体外迁移实验研究进展
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)迁移是血管术后内膜增生再狭窄病理进程的关键性阶段。趋化素样因子1(chemokine like factor 1，CKLF1)功能之一为调控VSMC迁移。传统体外迁移实验制约了VSMC的生长微环境，同样也降低了CKLF1调控VSMC迁移研究的可信级别；应用微流控技术可在体外重建VSMC微环境，表征VSMC在CKLF1作用下的迁移并探讨CKLF1调控VSMC的机制，进而在新细胞研究平台上，为再狭窄提供新的研究思路。
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趋化素样因子1对人血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响
目的 观察趋化素样因子1(CKLF1)对人血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及凋亡的影响,初步探讨其对凋亡抑制基因( Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)表达水平的调控.方法 腺病毒介导CKLF1基因修饰VSMC,CCK8法测定其对细胞增殖的影响;流式细胞仪观察细胞周期变化和凋亡情况;实时定量PCR和Western印迹法分别检测细胞内Bcl-2、Bax的mRNA和Caspase-3蛋白的表达情况.结果 观察期内CKLF1基因修饰的VSMC生长增殖被明显促进,24、48和72 h细胞周期S期的比例分别为15.8％±3.4％、25.5％±9.8％和37.2％±3.3％,较对照组细胞内DNA合成活跃(P＜0.05);血清饥饿刺激后CKLF1组各时相细胞凋亡率较对照组明显减少(5.5％±1.3％、7.6％±0.7％和11.4％±5.5％,P＜0.05).作用时间各时相内CKLF1可持续降低Bax mRNA(0.96±0.14、0.61±0.15和0.37 ±0.05)及Caspase-3蛋白(1.94±0.30、1.09 ±0.17和0.73±0.09)的表达,并上调Bcl-2 mRNA(1.59±0.18、2.05 ±0.51和2.96 ±0.27)的表达.结论 CKLF1可诱导人血管平滑肌细胞增殖和抗凋亡,其潜在机制可能与CKLF1上调Bcl-2水平,继而降低Bax和Caspase-3表达有关.
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趋化素样因子1过表达促进强直性脊柱炎髋关节韧带成纤维细胞增殖和向成骨细胞转化的实验研究
目的 探索趋化素样因子1(CKLF1)对AS髋关节韧带成纤维细胞增殖和向成骨细胞转化的影响.方法 正常和AS髋关节韧带组织分别取自我科6例股骨颈骨折和4例重度AS拟行髋关节置换的患者.组织经常规消化得单细胞,并行倒置相差显微镜观察和抗波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色(IFC)检测.对上述髋关节韧带组织及成纤维细胞分别行原位(in situ)和体外(in vitro)培养,重组腺相关病毒(rAAV)-lacZ、rAAV-hCKLF1转染21 d后收集标本.细胞增殖、致炎性细胞因子分泌、成骨关键靶基因、CKLF1及CCR4表达等分别采用ELISA、IFC和荧光定量反转录(RT)-PCR检测.各组间数据用单因素方差分析(LSD法),2组间比较采用t检验.结果 第2代正常和AS细胞抗vimentin IFC检测均为阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞.rAAV-hCKLF1转染21 d后,苏木精-伊红(HE)染色并计数单位面积下的细胞数、水溶性四氮唑法(WST-1)检测细胞增殖能力和Hoechst 33258检测细胞DNA含量均显示,CKLF1转染促进细胞增殖[与无病毒转染组、lacZ组相比,差异具有统计学意义(F=6.98,64.32,115.91;P<0.05或P<0.01)];正常和AS髋关节韧带组织及成纤维细胞分泌的致炎性细胞因子(IL-6和TNF-α),均明显升高[与无病毒转染组、lacZ组相比,差异具有统计学意义(F=34.57,8.89;P<0.05或P<0.01)];此外,与无病毒转染组、lacZ组及正常成纤维细胞的各组相比,CKLF1尚能促进AS成纤维细胞表达特异性骨细胞外基质蛋白[骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OCN)];荧光定量RT-PCR也得到了与上述检测结果相近的发现.结论 过表达CKLF1促进成纤维细胞增殖和致炎性细胞因子分泌,增强成骨相关靶基因的转录,推测CKLF1可能在AS关节病理性骨化过程中发挥重要作用.
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C19、C27多肽对人主动脉平滑肌细胞的趋化活性
趋化因子超家族（ CKLFSF）在人类有九个成员，即：趋化素样因子（ CKLF）和CKLFSF1～8。该基因家族的基因编码的产物特点为其结构介于经典的趋化因子和四次跨膜蛋白之间。CKLF1具有CC家族趋化因子的结构特征和基本功能，即连续两个半胱氨酸的特征性结构和趋化功能〔1〕。本研究选择CK-LF1 C端的两段多肽--C19、C27多肽，体外观察二者对人主动脉平滑肌细胞的趋化活性。
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CKLF1高表达激活NF-κB信号通路导致小鼠肺部炎症
目的 有报道表明趋化素样因子1(CKLF1)在哮喘病人肺部高表达,但具体情况和机制尚不明确.本研究拟在动物水平考察CKLF1的致炎作用及相关机制.方法 将pCDB-CKLF1质粒或空载体pCDB电转入Balb/C小鼠体内,HE染色观察其肺部病理改变;硝酸酶还原法和ELISA法分别检测小鼠血清中NO和TNF-α的含量;提取小鼠肺部组织的胞质和胞核蛋白,蛋白免疫印迹实验考察胞质和胞核内NF-κB和IκBα表达的改变.结果 病理切片结果显示,转染pCDB-CKLF1质粒后,小鼠肺部出现明显的病理改变;小鼠血清中NO和TNF-α含量明显升高;胞质内NF-κB和IκBα表达明显减少,胞核内NF-κB和IκBα表达明显增加.结论 趋化因子CKLF1高表达能够导致动物肺部炎症的发生,CKLF1可能通过激活NF-κB 信号通路导致炎症.
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神经生长因子抗体对哮喘模型大鼠肺中趋化素样因子1表达的影响
目的 观察神经生长因子(NGF)抗体对OVA诱导的哮喘模型大鼠肺中趋化因子CKLF1的表达变化.方法 采用OVA诱导的大鼠哮喘模型,通过腹腔给予NGF(8 ng·kg-1)及NGF抗体(0.1 mg·L-1),采用Western blot、ELISA和免疫组化观察CKLF1在支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织中的表达变化.结果 CKLF1在OVA诱导的哮喘模型大鼠肺组织中的蛋白表达升高(P<0.05);NGF抗体能够降低CKLF1的表达;CKLF1在哮喘大鼠BALF中的含量升高(P<0.05),NGF抗体能够降低BALF中CKLF1的含量(P<0.05);NGF对肺组织及BALF中CKLF1的表达没有明显的影响.结论 NGF抗体能够抑制哮喘模型大鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液中CKLF1的表达和释放,改善哮喘症状.
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趋化素样因子1对血管平滑肌细胞核因子-κB的影响
目的 应用重组腺病毒载体介导的趋化素样因子1(CKLF1)基因转染大鼠血管平滑肌细胞(SMC),观察CKLF1对SMC内核因子(NF)-κB活性的影响.方法 用腺病毒介导的CKLFl以不同时间梯度转染刺激SMC,采用免疫细胞化学、荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot 等方法 分析细胞内CKLF1和NF-κB激活表达.结果 静息状态下SMC中NF-κB有基础表达量,经CKLF1刺激后2～14 d,其活性迅速增加,免疫细胞化学染色细胞质和核呈棕色,CKLF1荧光定量PCR和Western blot结果 分别为1.0500±0.0681、3.3090±0.1523、2.8540±0.1219、1.7050±0.0944、1.4350±0.0858和1.186±0.061、2.264±0.185、2.397±0.149、1.617±0.101、1.381±0.033,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).NF-κB的Western blot结果 为1.184±0.111、2.046±0.221、1.747±0.068、1.498±0.051、1.412±0.087,与对照组比较5～14 d差异有统计学意义(P＜0.05).两组刺激后5～8 d为表达高峰期,且NF-κB活性与CKLF1表达量间明显相关.结论 CKLF1可导致NF-κB表达增加并随刺激时间梯度改变,提示NF-κB信号通路可能参与了CKLF1对SMC的增殖和迁移作用.
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趋化素样因子1对大鼠血管平滑肌细胞增殖活性的影响
目的探讨大鼠趋化素样因子(Cklf1)在体外对血管平滑肌细胞增殖活性的影响.方法将pCDB/Cklf1真核表达载体(实验组)和空载体pCDB(对照组)分别转染COS-7细胞,获取上清液,刺激原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,并比较在光镜和电镜下形态学的改变.结果以10%胎牛血清稀释的实验组上清与对照组相比,MTT法检测的A值在刺激大鼠平滑肌细胞48和72 h后差异有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01,n=5).两组细胞光镜下形态学无明显差异,电镜下经Cklf1刺激后的平滑肌细胞亚细胞器及肌丝和致密体增多.结论Cklf1在血管平滑肌的增殖过程中发挥重要作用.
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CKLF－1在特应性皮炎发病机制中的研究进展
特应性性皮炎( AD)病因以及发病机制复杂，目前仍未完全明确。活化T淋巴细胞浸润为AD患者皮肤炎症皮损处特征，但是，目前仍不清楚浸润的是哪些T淋巴细胞亚群，如何被参与招募并聚集在皮损部位，发挥什么样免疫损伤作用。免疫学研究显示，趋化因子对于淋巴细胞的招募、聚集并发挥炎症反应至关重要。趋化因子是一类具有趋化活性的细胞因子，在机体的免疫调节、过敏反应、炎症反应、细胞增殖分化等过程中发挥重要作用，因此，本文围绕CKLF1(趋化素样因子1)与T淋巴细胞亚群及功能之间的关系，就CKLF-1在特应性皮炎发病机制中的研究进展作一综述。
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CKLF1及其拮抗肽C19在不同时期特应性皮炎患者外周血T细胞亚群中的作用
目的 探讨趋化素样因子1(CKLF1)及其拮抗肽C19对不同时期特应性皮炎(AD)患者外周血T细胞亚群的作用.方法 应用淋巴细胞分离液分离急性期和慢性期AD的外周血单个核细胞(PB-MC),运用流式细胞术(FACS)检测CKLF1在其外周血T细胞亚群中的表达,并与正常对照组比较;体外诱导培养AD患者的Th1,Th2细胞亚群,以不同浓度CKLF1和(或)C19刺激上述细胞,并采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ,IL-4,IL-17水平变化.结果 急性期AD患者Th2细胞中CKLF1的表达高于对照组(P＜0.05),慢性期AD患者Th1细胞中CKLF1的表达高于对照组(P＜0.05).AD患者外周血CKLF1在Th17细胞中表达与正常对照组间差异无统计学意义.急性期AD患者体外培养的Th2细胞产生的IL-4水平高于对照组(P＜0.05),慢性期AD患者体外培养的Th1细胞产生的IFN-γ水平高于对照组(P＜0.05).IL-17在急性期和慢性期AD患者体外培养的Th1细胞中的水平与正常对照组相比差异均无统计学意义.急性期AD患者的Th2细胞经CK-LF1刺激,产生IL-4水平高于未刺激组(P＜0.05).经CKLF1和C19(10ng/mL)共同培养后,IL-4的水平降低.慢性期AD患者的Th1细胞经CKLF1刺激,产生IFN-γ的水平高于未刺激组(P＜0.05).经CKLF1和C19(10ng/mL)共同培养后,IFN-γ的水平无显著改变.结论 CKLF1在AD患者发病中可能起着重要的病理性作用,CKLF1的拮抗肽C19可能对急性期AD患者具有潜在治疗作用.
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趋化素样因子-1在卵巢癌中的表达及临床意义
目的 研究趋化素样因子-1(chemokine like factor-1,CKLF-1)在上皮性卵巢癌中的表达,探讨其与卵巢癌的关系及其临床生物学意义.方法 采用免疫组化方法测定卵巢癌组织CKLF-1的表达,用人工半定量判定结果,并与各项临床指标进行统计学分析.结果 CKLF-1在正常卵巢、良性及恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达水平依次增高(P<0.05),分别为0、0、45%;手术病理期别高、远处转移、有腹水的患者癌组织CKLF-1表达量高(P<0.05).结论 CKLF-1可能与上皮性卵巢癌的发生侵袭、转移及不良预后相关.
