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HPV18 E5蛋白稳定表达株的筛选及对细胞增殖和周期的影响
本研究筛选能稳定表达HPV18 E5蛋白的细胞株,并检测HPV18 E5蛋白对细胞增殖及周期的影响.通过PCR方法扩增得到HPV18E5基因,经酶切和连接构建含His标签的pSecTag-HPV18E5真核表达质粒.运用脂质体介导的方法将重组质粒转染Balb/c3T3细胞,并用含有博来霉素的培养基筛选阳性细胞株.利用Westernblot和免疫酶法鉴定HPV18E5在细胞中的表达.运用CCK-8法、流式细胞术检测HPV18E5对细胞增殖及细胞周期的影响.结果显示pSecTag-HPV18E5真核表达质粒构建成功;重组质粒转染Balb/c3T3细胞后,经400μg/mL博来霉素筛选21d,得到稳定表达HPV18 E5蛋白的细胞株;与对照组相比,HPV18 E5稳定表达细胞株的细胞增殖能力明显增强,细胞周期中S期的比值明显增加.研究表明HPV18 E5对细胞增殖及细胞周期有影响.本结果为进一步深入研究HPV18 E5蛋白的生物学特性及致癌作用奠定了基础.
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HPV 18 L1病毒样颗粒的表达纯化及其豚鼠抗血清制备
目的 优化人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期基因L1并在昆虫细胞中表达,获得HPV 18 L1病毒样颗粒(VLP),制备豚鼠抗血清.方法 联合利用昆虫细胞偏性密码子、C末端截短32个氨基酸、降低mRNA二级结构等策略优化HPV 18 L1基因,合成后克隆入pFastBacl载体,构建重组病毒,感染sf9昆虫细胞72 h后进行Western blot表达鉴定,密度梯度离心法纯化后进行纯度鉴定及形态学鉴定,获得HPV 18 L1 VLP,联合弗氏佐剂免疫豚鼠制备抗血清.结果 HPV 18 L1优化基因在昆虫细胞中可有效表达,纯化的HPV 18 L1蛋白纯度达90%以上,电镜观察可见直径约为50 nln的VLP,豚鼠免疫血清中HPV 18 L1 VLP特异性抗体滴度达5.12×105.结论 HPV 18 L1优化基因可在昆虫细胞中高效表达并组装成VLP,制备的高滴度抗血清为HPV 18 L1 VLP疫苗的进一步研究打下基础.
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人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性
目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价.方法将HPV1gL1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNA-L1.使用脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,用Western blot检测体外瞬时表达的抗原.将重组质粒pcDNA-L1肌肉注射BALB/c小鼠(100μg/只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布.采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价.结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18 L1蛋白.小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18 L1抗体和特异条带.免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体.结论HPV18 L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPV DNA疫苗打下了基础.
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RNA干扰沉默食管癌细胞株ECA109中人乳头瘤病毒18型E6、E7基因对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响
目的 应用RNA干扰(RNAi)技术,使人乳头瘤病毒18型(HPV18) E6、E7基因表达下调或缺失,观察下调或缺失后的HPV18阳性食管癌细胞株ECA109细胞内的人类白细胞抗原(HLA)-Ⅱ类分子表达.方法 将合成并包装好的含有E6、E7基因片段的短发卡RNA (shRNA)腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP、shpAd-E7-eGFP)感染食管癌细胞株,并用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)[E6 siRNA组HLA-ⅡmRNA表达量是空白组的1.27倍,E7 siRNA组HLA-ⅡmRNA表达量是空白组的1.66倍(P＞0.05]和Western blot技术[各组ACTIN蛋白条带灰度基本一致,shRNA-E6、shRNA-E7、无关序列和阴性对照组蛋白表达分别为0.5543、0.7246、0.4452、0.4365,siRNA E6、E7实验组灰度稍高于空白组(P＞0.05)及无关序列组]以β3-actin为内参照,在基因和蛋白水平上检测E6、E7和胞内HLA-Ⅱ类分子的表达.结果 2条含有E6、E7基因片段的shRNA腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP、shpAd-E7-eGFP)能有效的抑制ECA109细胞中HPV18 E6、E7的转录及表达,抑制率分别为92％和89％,细胞内HLA-Ⅱ类分子的表达上调,分别是空转染组及无关序列组的1.27和1.66倍,无关序列组和空白对照组HPV18 E6、E7及HLA-Ⅱ的mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HLA-Ⅱ类抗原表达的缺失可能与食管癌中的HPV感染及作用明显相关.
关键词： RNA干扰 人类白细胞抗原Ⅱ类抗原 人乳头瘤病毒18型 食管癌 -
HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达
目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体,并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响,探索反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性.方法 以HPV18型全基因质粒为模板,PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段,利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP-C1,EcoR I酶切并测序鉴定;采用脂转法将重组质粒pEGFP-HPV18E6E7as(EGFP-18AS)转染宫颈癌HeLa细胞株,通过RT-PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达.结果 成功构建HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体EGFP-18AS,经脂质体转染HeLa细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光,且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调.结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18 E6、E7癌基因的表达,为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法.
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宫颈癌组织高危HPV18 L1基因的克隆及序列分析
目的克隆和分析人乳头瘤病毒18型晚期表达基因L1序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础.方法采用PCR技术扩增了1例HPV18阳性宫颈腺癌患者癌组织中HPV18 L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析.结果本例宫颈癌临床标本HPV18 L1基因与GenBank收录的原型比较有12个碱基变异,推导其编码的氨基酸也发生了变化.结论本例中国人宫颈癌HPV18 L1基因有一定的变异.
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GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位
目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位.方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达.结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光.Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达.结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆.
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pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达
目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.
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HPV18型E6蛋白抗原表位预测与分析
目的 用生物信息学方法分析预测HPV 18型E6蛋白的B细胞和T细胞表位,为宫颈癌免疫治疗的疫苗及药物开发提供参考靶点.方法 基于NCBI中HPV18型E6蛋白的氨基酸序列,利用DNA star软件预测其二级结构、亲水性、表面可及性及柔韧性;利用ABCpred软件预测出其B细胞表位;综合使用CTLPred和NetMHC 4.0软件分析其CTL表位;ProPred和NetMHCIIpan 3.1软件预测其Th表位.结果 HPV 18型E6蛋白二级结构中α螺旋和β转角较多且分布较为均匀;预测出了4个B细胞表位,它们大多与亲水性强、表面可及性好、柔韧性好的蛋白区域重叠,易于结合抗体;E6蛋白具有丰富的细胞毒性和辅助性T细胞表位.结论 HPV 18型E6蛋白作为宫颈癌免疫治疗的理想靶点具有同时诱导特异性体液免疫和细胞免疫的潜能,通过对其B/T细胞抗原表位的预测为免疫治疗相关疫苗及药物抗原肽的选择提供了理论依据.
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利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性
目的 建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究.方法 建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证.结果 ZsGreen法的HPV16/18假病毒佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性.结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究.
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HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响
目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础.方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFP-C1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD.将3种真核表达载体及pEGFP-C1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达.通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF-α和IL-1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡.结果:GFP-E2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFP-DBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFP-TAD仅表达于细胞质.GFP-E2、GFP-TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量增加,且GFP-TAD作用强于GFP-E2.而EGFP-DBD无此作用.结论:HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β.
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人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达
目的构建HPV 18 L1-E6、L1-E7嵌合基因的表达载体, 并在CHO细胞中表达.方法克隆HPV 18 L1-E6和L1-E7基因, 插入中介载体pGEMT-Easy中并测序鉴定.采用PCR定点突变法, 突变L1-E6、L1-E7基因序列中与转化作用相关的位点, 分别与L1基因连接后插入真核表达载体pVAX1, 构建真核表达质粒pVAX1-L1E6Mxx、 -L1E7Mxx.用磷酸钙沉淀法, 转染CHO细胞, 以抗HPV-18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体(mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测.结果 ELISA检测显示, 转染各种pVAX1-L1E6Mxx、 -L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P-N值均>2.1; 免疫细胞化学检测, 在胞浆、 胞核可见棕黄色颗粒.结论所构建的pVAX1-L1E6Mxx-E7Mxx融合蛋白表达质粒, 可在转染细胞内表达相应的L1-E6Mxx和L1-E7Mxx蛋白, 为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础.
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人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应
目的: 检测HPV 18 L1-E6、 E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应.方法: 将实验动物BALB/c小鼠54只随机分为9组, 按不同免疫方式(肌肉接种或鼻内滴注)分别给予不同的重组质粒(pVAX1-L1-E6M3或pVAX1-L1-E7M3)和免疫佐剂(pLXHDmB7-2或LTB).用免疫原免疫3次, 末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测.末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应(DTH)试验.断足进行小鼠足垫HE染色.取小鼠脾脏制成单细胞悬液, 进行脾细胞增殖试验, 并进行CD4+/CD8+ T细胞中IFN-γ+或IL- 4+细胞的FACS分析.结果: 与对照组相比, 各实验组均获得明显的免疫效果.实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前; 肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高.实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结, 镜下观察可见大量单核细胞侵润.肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数(SI)和CD8+ IFN-γ+细胞数均高于鼻内滴注组; 而鼻内滴注组CD4+ IL- 4+细胞数高于单纯质粒肌肉接种组; 加入pLXHDmB7-2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组.结论: 证实了重组pVAX1-HPV18 L1/E6、 E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应.同时, 证实B7-2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应效果.
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人乳头瘤病毒18型 L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成
目的：利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型（HPV18）L1蛋白，纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒（VLPs），为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成，经PCR扩增出截短的HPV18L1基因，构建重组表达载体PET30a-L1，通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白，其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后，获得高纯度的的L1蛋白，再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达，纯化后的蛋白纯度达到90％以上，电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白，并获得均一的VLPs颗粒，为疫苗的开发奠定基础。
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HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达
目的 分析HPV18E2蛋白的CTL表位,合成并纯化这些表位多肽,构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞,检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果,为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础.方法 以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段,将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2-EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.51Cr释放实验评估CTL杀伤能力.结果 克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2-EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%.结论 三条备选肽段都具有明显的杀伤效应,均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位.
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毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度
目的:建立毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度.方法:采用50 μm×57 cm(有效长度50cm)无涂层毛细管.进样时方法设置为:进样5 kV,20 s;分离电压为15 kV,维持30 min,两端加压138 kPa;温度:25 ℃;检测波长:220 nm.结果:毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒(HPV) 16型、18型原液主峰分离度分别为2.4和3.0,HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.125 ～0.750 mg·mL-1时线性关系良好(HPV 16L1,r =0.9836;HPV 18L1,r =0.9931).HPV 16L1和HPV 18L1原液的精密度和稳定性试验的RSD均＜2.0％.结论:本文建立的方法可用于重组人乳头瘤病毒原液的纯度检测.
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Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数
目的:建立Biacore法测定重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗原液的动力学常数.方法:分别将HPV 16·V5中和单抗与HPV 18·J4中和单抗偶联到CM5芯片上,然后根据Biacore X-100 Kinetics/Affinity控制软件将HPV 16L1和HPV18L1原液分别稀释至适当的不同浓度,采用50 mmol·L-1氢氧化钠溶液作为再生液进行动力学分析.根据Biacore X-100Evaluation分析软件进行拟合,得到样品的动力学常数KD值.结果:Biacore法测定重组人乳头瘤病毒16型、18型原液动力学常数KD分别为4.844 × 10-10 mol·L-1和1.67 × 10-10 mol·L-1,HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.625～40 μg· mL-1时线性关系良好(HPV16L1:Y=17.77X-0.0184,r=1.000;HPV 18L1:Y=18.73X+5.282,r=0.9957).HPV 16L1和HPV18L1原液精密度和稳定性试验的RSD均＜20％.并且Biacore法测定的结合常数ka值和体外相对效力测定(IVRP法)的EC50值之间具有一定的相关性.结论:该方法实时、简便、快速、准确、灵敏,适用于重组人乳头瘤病毒原液的动力学分析.
