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稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立
目的 建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株.方法 以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR-26a序列418bp,片段两侧添加Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,In-Fusion克隆至pHAGE-fullEF1 a-MCS-IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定；所构建的载体命名为pLVT-miR26a.获得pLVT-miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产；携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、人肝癌细胞(BEL-7402、HepG2、Sk-Hep-1、HepG2-luc),以建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞系；qRT-PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平.结果 测序和酶切证实成功构建了pLVT-miR26a,按标准程序生产的携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞.结论 成功建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础.
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利用假病毒法检测重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗的免疫原性
目的 建立并验证重组人乳头瘤病毒双价(16/18型)疫苗中和滴度的检测方法,并且利用此假病毒法进行免疫原性研究.方法 建立并优化以ZsGreen假病毒为基础的中和实验(ZsGreen法)测定血清中和滴度,比较荧光显微镜观察与微流式细胞分析法、流式细胞分析法的差异,并对专属性、精密度、耐用性、假病毒稳定性和不同细胞代次的影响进行了方法学验证.结果 ZsGreen法的HPV16/18假病毒佳接种量为1 600 TCID50,HPV16型与HPV18型无交叉,具有良好的专属性和精密度,采用不同细胞代次与不同批次假病毒进行检测,均能获得较好的重复性.结论 ZsGreen法假病毒中和滴度检测法准确可靠、重复性好,经方法学验证后此法适用于疫苗的免疫原性研究.
