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靶向STAT5的siRNA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡
目的 采用RNA干扰技术阻断STAT5基因的表达,观察其对人肝癌SMMC-7721凋亡的影响.方法 构建3种靶向STAT5的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,采用LipofectamineTM2000转染肝癌细胞SMMC-7721;分别采用半定量RT-PCR、Western blot技术检测转染前后SMMC-7721细胞STAT5 mRNA和蛋白质表达的变化;采用透射电镜技术观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 3条靶向STATS的序列特异性的siRNA可以有效地抑制SMMC-7721细胞STATS mRNA和蛋白质表达,STAT5 mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,STAT5蛋白表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%;转染靶向STAT5的siRNA真核表达载体48 h后出现凋亡细胞的典型形态学变化,并诱导25.61%的SMMC-7721细胞发生凋亡.结论 靶向STAT5的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断SMMC-7721细胞STAT5基因的表达,并能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,STAT5 siRNA在人肝癌的基因治疗中可能具有潜在的应用价值.
关键词： STAT5 siRNA 凋亡 人肝癌细胞SMMC-7721 -
靶向阻断STAT5对白血病K562细胞周期的影响
目的通过应用诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)抑制信号转导因子和转录激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5, STAT5)信号转导途径,观察对白血病K562细胞细胞周期的影响,初步探讨其中的分子机制.方法体外设计合成STAT5 Decoy ODNs,在脂质体的介导下转染K562细胞,FCM检测细胞周期,用RT-PCR和Western blot方法检测STAT5下游基因细胞周期素D1 (cyclin D1)和c-myc的表达.结果 Decoy ODNs作用K562细胞24 h后的细胞周期显示,S期细胞由(48.71±5.42)%减低为 (31.94±2.35)%,G0/G1期细胞由 (40.83±5.20)%增加为 (61.39±2.18)%;而错配寡核苷酸(mutant ODNs)对细胞周期没有明显影响.RT-PCR实验和Western blot实验证实Decoy ODNs作用引起STAT5下游基因cyclin D1和c-myc mRNA和蛋白表达下调.结论 STAT5 Decoy ODNs能抑制细胞G1/S转换而影响细胞周期进程,其作用机制可能与Decoy ODNs下调STAT5下游cyclin D1和c-myc基因的表达有关.
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双重免疫组化技术检测乳腺癌STAT5和ER相关表达的意义
目的 优化双重免疫组织化学技术,检测乳腺癌中STAT5和ER蛋白表达的相关性,并分析两者联合检测在乳腺癌治疗方案的制定及预后评估中的参考意义.方法 用不同染色顺序优化双重免疫组织化学技术,并用优化的方法 检测50例乳腺癌组织中STAT5和ER蛋白的共表达.结果 染色顺序为STAT5→NBT/BCIP显色→ER→DAB显色者阳性对比明显,双标记效果理想;乳腺癌肿瘤细胞STAT5-ER双标记阳性率、ER单标记阳性率均高于STAT5单标记阳性率,差异有显著性(P<0.05),而双标记阳性率和ER单标记阳性率比较无显著性差异.结论 应用优化的双重免疫组织化学技术检测乳腺癌组织中STAT5和ER的相关表达,有助于指导临床预测乳腺癌的内分泌治疗反应及其预后.
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慢性重组人生长激素对小鼠肝脏STAT5的影响及其机制
目的研究慢性重组人生长激素（rhGH）刺激对幼鼠肝脏STAT5的影响及其分子机制。方法将32只幼鼠共分为4组：磷酸盐缓冲液（PBS）组、PBS＋ single rhGH 组、chronic rhGH 组、chronic rhGH＋ single rhGH 组。慢性生长激素刺激组chronic rhGH和chronic rhGH＋single rhGH两组共16只小鼠每天按照1μg/g的剂量腹腔注射 rhGH ，对照组和 PBS＋ single rhGH组16只小鼠每天腹腔注射等体积 PBS 0．1 mol/L ，共3周。注射完后1次 rhGH和 PBS 16 h 后次日8：00，处死前30 min PBS组和chronic rhGH组小鼠注射PBS 0．1 mol/L ，PBS＋single rhGH和chronic rhGH＋single rhGH组小鼠按1μg/g注射单剂量rhGH。结果慢性生长激素刺激组小鼠（chronic rhGH和chronic rhGH＋ single rhGH）与对照组小鼠（PBS组和 PBS＋single rhGH）相比体质量明显增加；与 PBS组相比，chronic rhGH组小鼠肝脏GH信号通路内基础p-STAT5水平显著降低；凝胶迁移实验检测的chronic rhGH组小鼠肝脏内STAT5与DNA的结合能力显著低于PBS组；处死前30 min按1μg/g单剂量注射rhGH 的小鼠中，chronic rhGH＋single rhGH组较 PBS＋single rhGH组小鼠肝脏p-STAT5水平则明显降低；chronic rhGH组与对照组相比，CIS含量显著升高，而SOCS-2的含量则无明显差异。结论 rhGH 慢性刺激可抑制幼鼠肝脏细胞内STAT5的磷酸化，其机制可能与CIS含量的升高有关。
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STAT5基因对人膀胱癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及作用机制
目的 研究STAT5基因高表达及沉默对人膀胱癌细胞系5637和T24顺铂化疗敏感性的影响及分子机制.方法 冲击诱导方法构建顺铂耐药细胞株T24-cisplatin和5637-cisplatin,Western bolt法检测STAT5的表达;构建STAT5过表达载体,应用脂质体转染5637和5637-cisplatin细胞,用针对STAT5基因的特异性shRNA转染T24和T24-cisplatin细胞,MTT法和流式细胞凋亡法检测转染前后膀胱癌细胞顺铂化疗的细胞生存率和凋亡率,及Western blot法检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3表达.结果 顺铂耐药细胞株5637-cisplatin和T24-cisplatin STAT5表达明显高于顺铂敏感株5637和T24(P =0.004;P =0.001),而5637-cisplatin和T24-cisplatin细胞沉默STAT5其化疗敏感性显著升高(P =0.003,P=0.001).5637细胞过表达STAT5其化疗敏感性显著下降(P =0.021),顺铂化疗的细胞凋亡率明显下降(P =0.002),Bax、Caspase-3表达水平显著降低(P =0.014;P =0.033),Bcl-2表达水平显著升高(P=0.001).T24细胞STAT5被沉默后其化疗敏感性显著增强(P=0.011),顺铂化疗的细胞凋亡率明显上升(P=0.001),Bax、Caspase-3表达水平显著升高(P =0.001;P=0.007),Bcl-2表达水平显著降低(P =0.020).结论 STAT5表达情况与膀胱癌细胞顺铂化疗敏感性具有相关性,其可能分子机制为调控凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase-3介导细胞顺铂耐药.
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EGF通过STAT5调控肺腺癌A549细胞中COX-2的机制
背景与目的 已有的研究表明COX-2在肺癌发生发展过程中起关键作用,它被一些细胞因子和生长因子所诱导产生,并受到JAK/STAT等信号通路的调控,抑制COX-2的表达能阻止肺癌的发展.本研究旨在探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在人肺腺癌A549细胞中对STAT5激活效应,以及STAT5信号通路对COX-2调控机制.方法 应用免疫荧光法及Western印迹法检测人肺腺癌A549细胞中EGF对STAT5的激活现象.分别用野生型STAT5(AdWT STAT5),STAT5显性负突变体(AdCMV5 Stat5a△740)以及STAT5 siRNA转染A549细胞,并用EGF对后两组转染细胞加以刺激,使STAT5及P-STAT5的表达发生变化,再用RT-PCR检测A549细胞中的COX-2 mRNA表达.结果 在体外A549细胞中STAT5无激活；EGF可以诱导STAT5的激活,促使磷酸化的STAT5穿梭入核；STAT5的激活是EGF诱导COX-2上调表达的必要条件；非磷酸化的STAT5可能通过非转录激活的途径参与了COX-2表达的调控.结论 在A549细胞中STAT5可以通过磷酸化和非磷酸化两种途径来实现对COX-2的调控.
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冬凌草甲素抗T细胞急性淋巴细胞白血病效应的实验研究
目的 探讨冬凌草甲素对T细胞急性淋巴细胞白血病的抗白血病效应及其机制.方法 以T细胞急性淋巴细胞白血病细胞株CEM为研究对象,应用改良MTT法测定不同浓度及不同时间冬凌草甲素对CEM细胞增殖和生存率的影响,计算72 h的半数抑制浓度(IC50);显微镜下观察5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素处理24 h后CEM细胞的形态学变化;流式细胞术检测0.5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后CEM细胞的凋亡百分率;应用Western blot法检测7.5 μmol/L冬凌草甲素作用后细胞mTOR、P70、4EBP1、RAF、ERK、STAT5信号蛋白水平,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化.结果 ①冬凌草甲素呈浓度及时间依赖性抑制CEM细胞增殖,作用72 h的IC50值为(7.37±1.99)μmol/L;②5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后CEM细胞边界不清晰,部分细胞崩解,且浓度越高,细胞形态改变越明显;③0、5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后,细胞凋亡百分率分别为(4.8±2.11)％、(19.03±2.54)％、(40.27±3.31)％;(57.23±6.69)％;④冬凌草甲素明显抑制CEM细胞mTOR、P70、4EBP1、RAF、ERK、STAT5信号蛋白的活化;下调CEM细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达.结论 冬凌草甲素可能通过抑制mTOR/P70(4EBP1)、RAF/ERK、STAT5信号蛋白的活化,以及上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2而发挥抗白血病作用.
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生长激素和胰岛素对肝组织和HepG2细胞AKT、STAT5磷酸化的调节
生长激素(growth hormone,GH)在机体生长和代谢方面起到重要作用,在临床的使用日益广泛[1-4].GH介导的Janus激酶/信号转导子和转录活化子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路参与细胞的增殖、 分化、迁移及凋亡等重要生物学过程[5].GH和细胞膜上的GH受体(growth hormone receptor,GHR)相互作用后激活JAK2和GHR,进一步活化STAT5,STAT5转移到核内与其调节基因的启动子特殊序列结合,从而激活下游基因的转录[6].胰岛素是一种调节代谢和生长的重要激素,主要用于糖尿病的治疗.胰岛素与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合促进胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)的磷酸化,磷酸化的IRS和磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PDK)的调节亚基p85结合,进一步活化PDK.激活的PI3K可以通过活化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B,AKT)进而调控细胞代谢、增殖、分化与凋亡[7].GH和胰岛素在促进生长和调节代谢方面都有着重要作用,激素间的相互作用对生命的稳态具有重要的意义.然而,GH和胰岛素之间的相互作用有待更多地了解.研究表明GH和胰岛素存在着信号通路间相互作用[8-9].本研究在同样的技术背景条件下,同时研究2个激素间的相互作用对信号通路的影响.
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STAT5、cyclinD1和c-myc蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的:探讨信号转导和转录激活因子-5(STAT5)、细胞周期素D1(cyclinD1)和c-myc蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及意义.方法:用免疫组化SP法检测38例手术切除的NSCLC和20例正常肺组织中STAT5、cyclinD1和c-myc的表达.结果:STAT5、cyclinD1和c-myc在NSCLC中的表达明显高于正常肺组织(P＜0.01),且它们的表达与患者的年龄、肿瘤大小、组织分化程度、淋巴结转移及TNM分期等病理因素无关(P＞0.05).在NSCLC中,STAT5和cyclinD1的表达呈正相关(P＜0.05),而STAT5与c-myc的表达、cyclinD1和c-myc的表达无相关性.结论:在NSCLC中存在STAT5、cyclinD1和c-myc的过度表达,但与临床病理因素无关.在肿瘤的发生中,STAT5可能是通过上调cyclinD1表达,促进细胞周期进展和细胞转化,诱导肿瘤的形成.
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兔抗STAT5抗体的制备及其在乳腺癌诊断中的应用
目的:制备并纯化兔抗小鼠脾信号转导和转录激活因子5(STAT5)的抗体,分析其在乳腺癌细胞以及良恶性乳腺组织中的表达.方法:应用重组小鼠STAT5蛋白,常规免疫雄性新西兰兔制备抗STAT5抗体,并用盐析法和离子交换层析技术进行纯化.用免疫印迹法(Western blot)检测抗STAT5抗体的纯度和特异性,以及乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中STAT5蛋白的表达;用免疫组化SP法检测STAT5在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达.结果:以重组小鼠STAT5蛋白免疫新西兰兔6 wk后,用间接ELISA法检测静脉血中STAT5抗体的效价为1:204 800(A450=1.07).将STAT5经SDS-PAGE分离,可见1条相对分子质量(Mr)为90 000～95 000的蛋白带,与文献[3]的报道相符.用抗STAT5血清做Western blot分析显示,在Mr为90 000～95 000处也有1条明显的带,证明是抗STAT5的特异性抗体.将人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的细胞浆和细胞核蛋白,与所制备的抗STAT5抗体均可起反应.人乳腺组织切片用抗STAT5抗体做免疫组化染色显示,在正常乳腺组织细胞浆中可见棕黄色颗粒,而在乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中可见棕黄色颗粒.结论:制备了高效价、特异性的兔抗STAT5抗体.用该抗体检测证实,STAT5只在正常乳腺组织的细胞浆中表达,而在乳腺癌细胞STAT5的细胞浆和细胞核中均有表达,提示发生乳腺癌后,STAT5可由细胞浆易位入细胞核中表达,可作为乳腺癌临床诊断的参考指标.
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STAT5和Bcl-xl在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性分析
目的: 分析信号转导与转录激活因子5(Signal transducer and activator of transcripton 5, STAT5)与Bcl-xl(B-cell Lymphoma/Leukemia-xl)在非小细胞肺癌和肺正常组织中的表达及关系, 以进一步探讨STAT5和Bcl-xl与非小细胞肺癌发生与发展的关系.方法: 利用SABC免疫组织化学技术检测42例非小细胞肺癌(NSCLC)组织及15例肺正常组织中STAT5和Bcl-xl的表达.结果: (1)STAT5和Bcl-xl 在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于肺正常组织(P＜O.05).(2)STAT5和Bcl-xl的表达水平与非小细胞肺癌组织学类型有关, 在腺癌组织中的表达明显高于鳞癌, 与性别、年龄、肿瘤大小、组织分化程度、 TNM分期及淋巴结转移无关. (3)STAT5与Bcl-xl的表达呈显著正相关.结论: 本组资料提示STAT5与Bcl-xl可能在肺癌的发生发展中发挥重要作用, Bcl-xl的表达可能直接由STAT5调控.由此可望寻找到新的非小细胞肺癌的诊断方法和治疗靶点.
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Jak激酶抑制剂AG490对Lewis肺癌细胞增殖及Jak-Stat信号通路的影响
目的 探讨Jak激酶抑制剂AG490对Lewis肺癌细胞增殖与凋亡的作用及其机制.方法 AG490 作用于体外培养的Lewis肺癌细胞.MTT 法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡形态、流式细胞术检测细胞周期与凋亡,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Stat3、Stat5和Bcl-2、Bax mRNA表达.结果 100 μmol·L-1AG490作用24和48 h后,对Lewis肺癌细胞细胞增殖抑制率分别为37.95%和52.99%.流式细胞术显示,经50和100 μmol·L-1 AG490作用24 h后,细胞凋亡率由处理前的0.76%分别提高到12.56%和16.76%(P＜0.01).荧光显微镜下可见到典型的细胞凋亡形态学改变.细胞Stat3、Stat5活化程度降低,促进Bcl-2基因表达下调,提升细胞中Bax mRNA表达.结论 阻断Jak-Stat3信号通路可抑制Lewis肺癌细胞增殖,并可能通过下调凋亡抑制基因Bcl-2表达诱导细胞凋亡.
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人参多糖对人白血病细胞株K562细胞信号转导的调控
目的:研究人参多糖(GPS)对人红白血病细胞株(K562)信号转导的调控.方法:采用细胞体外培养技术,免疫细胞化学、Western Blot检测GPS诱导后K562细胞蛋白酪氨酸激酶JAK2、核因子NF-κB p65和信号传导及转录激活因子5(STAT5)的表达,免疫沉淀法检测GPS对K562细胞JAK2磷酸化的影响,RT-PCB技术检测GPS诱导后K562细胞c-myc,p53表达的变化.结果:免疫细胞化学和Western Blot检测GPS诱导后K562细胞,JAK2蛋白表达明显增强,随着剂量的加大、时间的延长更加明显[(12.33±2.05)vs(88.18±13.57)];NF-κB p65[(79.48±9.56)vs(6.98±1.45)]和STAT5[(71.56±16.28)vs(10.23±2.16)]蛋白表达明显减弱;GPs(40 mg/L)作用K562细胞6 d后,加入GM-CSF继续刺激5～10 min,JAK2酪氨酸磷酸化增强,而刺激20 min后JAK2酪氨酸磷酸化明显减弱.GPS(40 mg/L)诱导K562细胞3,6 d后.c-myc mRNA明显减弱[(196±12)vs(136±11)],而p53 mRNA无明显变化[(202±16)vs(181±16)].结论:GPS激活了酪氨酸蛋白激酶JAK2,促进其磷酸化,同时抑制STAT5,NF-κB信号转导途径,下调原癌基因c-myc表达,促进K562细胞凋亡与分化.
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STAT3、STAT5在NK细胞中的抗肿瘤作用研究进展
NK细胞构成机体抗肿瘤的第一道防线,STAT通路在其中发挥着重要的作用.无论是对肿瘤细胞的生长、肿瘤细胞的杀伤还是机体免疫细胞的相互调节,STAT通路均参与其中.其中抑制STAT3或激活STAT5都能增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用.STAT3与STAT5亦存在互相调节,影响多种细胞的生物功能,但在NK细胞中的研究较少.通过对近几年关于STAT3和STAT5在NK细胞中的抗肿瘤作用的调研,本文旨在为促进NK细胞在抗肿瘤中的应用提供理论依据.
关键词： NK细胞 JAK-STAT信号通路 肿瘤免疫 STAT3 STAT5
