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应用人胚肺成纤维细胞MRC-5培养分离寨卡病毒研究
目的 应用人胚肺成纤维细胞MRC-5培养并分离鉴定寨卡病毒.方法 收集寨卡病毒病确诊病例的精液样本并在MRC-5细胞中进行培养,观察致细胞病变效应(CPE).采用实时荧光PCR (real-time PCR)方法鉴定培养,同时对培养物进行序列测定和比对分析.结果 病例精液样本经MRC-5细胞盲传3代,未观察到明显的特异性致CPE,MRC-5细胞3代培养物寨卡病毒经real-time PCR检测结果呈阳性.毒株命名为Henan/001/2016,GenBank编号为MF593625,属于亚洲基因簇系.Henan/001/2016与Natal RGN株的亲缘关系为接近,在E基因区段的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.7％和100％.结论 MRC-5细胞适用于寨卡病毒的分离、培养和鉴定.
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实时细胞分析技术与Alamar Blue法用于测定纳米氧化铜细胞毒性的比较研究
目的 通过比较研究实时细胞分析技术(real time cell analyze,RTCA)及Alamar Blue法测定纳米氧化铜体外作用于人胚肺成纤维细胞MRC-5及人正常肺上皮细胞BEAS-2B的毒性作用,探讨RTCA实时细胞分析技术用于测定纳米材料体外细胞毒性的可行性.方法 分别将MRC-5及BEAS-2B细胞接种于RTCA配套16孔板中及普通96孔板中,96孔板中细胞用于Alamar Blue法测定细胞毒性.分别用剂量为0.75 g/L、0.38 g/L、0.19 g/L、0.094 g/L、0.047 g/L的纳米氧化铜混悬液进行染毒.选择12 h、24 h、36 h、48 h、60 h时间点计算两种方法测得的IC50值.采用SPSS 16.0分析软件,利用配对t检验,对两种方法所得相同时间点的IC50值进行统计分析,判断其相关性及是否存在差异.结果 MRC-5细胞用RTCA法测定染毒后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的IC50值分别为391 mg/L、249 mg/L、185 mg/L、165 mg/L、147 mg/L;Alamar Blue法所得相同时间点的IC50值分别为507 mg/L、206 mg/L、172 mg/L、154 mg/L、95.2 mg/L.两种方法所测得IC50值进行统计分析,差异无统计学意义.BEAS-2B细胞用RTCA法测定染毒后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的IC50值分别为131 mg/L、83.78 mg/L、65.37 mg/L、53.98 mg/L、51.23 mg/L;Alamar Blue法所得相同时间点的IC50值分别为148 mg/L、104 mg/L、77.3 mg/L、42.5 mg/L、39.2 mg/L.两种方法所测得IC50值进行统计分析,差异无统计学意义.结论 RTCA实时监测法与Alamar Blue法在相同时间点测定纳米氧化铜体外细胞毒性得IC50值差异无统计学意义,说明RTCA实时监测法测定体外细胞毒性结果可靠,适用于纳米材料的体外毒性研究.
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小檗碱对转化生长因子β1诱导人胚肺成纤维细胞转分化及丝裂原活化蛋白激酶信号通路蛋白磷酸化水平的影响
目的 探讨小檗碱对转化生长因子β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5转分化过程中细胞外羟脯氨酸和细胞内平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白及丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白磷酸化水平的影响.方法 体外培养MRC-5细胞,采用 MTT法检测不同浓度小檗碱对细胞增殖的抑制作用,确定适合的作用范围;Western blot法检测不同浓度转化生长因子β1刺激MRC-5细胞转分化过程中平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平,确定适宜的转化生长因子β1诱导浓度.不同浓度小檗碱预处理的MRC-5细胞经转化生长因子β1刺激后,采用比色法测定细胞外羟脯氨酸水平,对于细胞内平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白p38 MAPK、SAPK/JNK、ERK1/2的磷酸化水平采用Western blot法进行检测.结果 参考 MTT法检测结果,选定小檗碱适宜浓度(20、40、80μmol/L)进行研究.Western blot结果显示2 ng/ml浓度转化生长因子β1可明显诱导 MRC-5细胞转分化.小檗碱预处理的 MRC-5细胞,较单纯转化生长因子β1诱导细胞,培养液中羟脯氨酸水平明显降低.Western blot法检测结果显示,小檗碱预处理细胞较单纯转化生长因子β1诱导细胞,平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平明显受到抑制,丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白 p38 MAPK、SAPK/JNK、ERK1/2 磷酸化水平亦受到不同程度抑制.结论 小檗碱预处理对转化生长因子β1诱导的MRC-5细胞转分化过程有抑制作用,其机制可能与小檗碱下调丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白的磷酸化水平有关.
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组织工程化三维支气管模型体外再造的实验研究
目的 以人支气管上皮细胞系和人胎肺成纤维细胞系为种子细胞、胶原凝胶复合Matrigel为支架材料,探索采用体外构建组织工程化三维支气管模型的可行性,为研究支气管上皮细胞和成纤维细胞相互作用提供模型.方法 将支气管上皮细胞和肺脏成纤维细胞在添加Matrigel的液态Ⅰ型胶原中共培养,应用静态拉仲系统体外构建支气管模型.通过大体观察、相差显微镜观察、HE染色和免疫组织化学染色(广谱CK等)的方法对细胞的生长情况及形成的三维组织结构进行鉴定.结果 在体外应用静态拉伸系统能构建出组织工程化三维支气管模型.大体观察可以看到收缩良好的组织片层,并具有一定韧性;相差显微镜下可以观察到网状结构的形成,细胞活性良好;HE染色表明了三维刚状结构的形成;免疫组织化学染色广谱CK和Vimentin呈阳性.结论 体外成功构建出组织工程化三维支气管模型,种子细胞共培养可在支架材料中完成极性生长过程并形成网状结构.
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纳米氧化铁颗粒对A549和MRC-5细胞的氧化损伤及DNA损伤毒性评价
目的:比较氧化铁纳米颗粒诱导肿瘤细胞和正常细胞氧化应激损伤和DNA损伤程度的差异.方法:首先,测定胺基表面修饰的氧化铁纳米颗粒(Amine-IONP)对人肺腺癌细胞A549细胞和入胚肺纤维细胞MRC-5细胞生长的影响.然后,联合胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量、线粒体膜电位(mitochondtial membrance potential,MMP)和内质网状态(endoplasmic reticulum stress,ERS)等指标,评价Amine-IONP对A549细胞和MRC-5细胞的氧化损伤的差异.后,用碱性彗星电泳试验检测氧化铁纳米颗粒对2种细胞DNA损伤的差异.结果:Amine-IONP对MRC-5细胞增殖的抑制作用大于A549细胞(P＜0.05).Amine-IONP能诱导A549细胞ROS水平、ERS升高,MMP下降(P＜0.05),并呈明显剂量依赖性;而在Amine-IONP相同条件作用下,MRC-5细胞仅显示MMP水平出现显著性降低(P＜0.05),且变化程度与A549细胞相比显著较小(P＜0.05).彗星试验结果显示,Amine-IONP可导致A549和MRC-5细胞出现不同程度的DNA损伤(P＜0.05),且变化趋势与ROS水平变化相同.结论:Amine-IONP对A549细胞的毒性大于MRC-5细胞,对A549细胞的氧化损伤和遗传毒性均强于MRC-5细胞.研究数据为选择适宜的细胞系来评价纳米材料细胞毒性和遗传毒性提供了理论支持.
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TGF-β1-Smad2/3信号转导通路在百草枯中毒致肺纤维化中的作用
目的 观察百草枯(P Q)染毒对人肺成纤维细胞的影响,探讨P Q中毒致肺纤维化中转化生长因子β1-Smad2/3蛋白(TGF-β1)-Smad2/3信号转导通路的作用.方法 体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以终浓度为0、12.5、25、50、100、200、400μmol/L的PQ处理细胞24 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞存活率.使用终浓度50μmol/L PQ处理细胞6、8、12、24、48、72 h,检测PQ在不同时间点对细胞的损伤程度.终浓度0、25、50、100μmol/L PQ处理细胞24 h,酶联免疫吸附(ELISA)检测细胞TGF-β1蛋白表达水平,聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞TGF-β1 mRNA表达水平.为了观察PQ染毒对TGF-β1/Smad信号通路的影响,将MRC5细胞分成6组:正常对照组、25μmol/L PQ染毒组、50μmol/L PQ染毒组、100μmol/L PQ染毒组、TGF-β1阳性对照组、TGF-β1刺激组(100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1),免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Smad2/3蛋白(p-Smad2/3)表达水平.结果 与对照组比较,MRC-5细胞存活率随着PQ剂量和时间的增加明显降低(P<0.05),呈剂量和时间依赖性;ELISA显示,PQ作用MRC-5细胞24 h后,TGF-β1蛋白表达升高至37.4、48.8、39.3μg/ml,但诱导作用呈非剂量依赖方式;RT-PCR显示,随着PQ浓度增加TGF-β1 mRNA表达水平明显升高,分别是对照组的3.5、6.9和9.7倍,诱导作用呈剂量依赖方式(P<0.05);Westem blot显示,浓度为25、50、100μmol/L PQ作用细胞24 h后,p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),给予细胞100μmol/L PQ+50μmol/L TGF-β1共同刺激下,p-Smad2、p-Smad3蛋白量达到多(P<0.05).结论 TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的异常表达参与了PQ致MRC5细胞损伤过程,TGF-β1/Smad信号通路激活在PQ致肺纤维化中发挥重要作用.
关键词： 百草枯 MRC-5细胞 肺纤维化 TGF-β1/Smad信号转导通路 -
牛副流感病毒3型在不同细胞中的复制动力学分析
目的 对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)在Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞中的复制动力学进行分析.方法 将BPIV3分别接种至Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE)情况;采用直接免疫荧光抗体法检测3种细胞盲传3代后BPIV3的增殖情况;将病毒滴度为1.0×104 TCID50/ml的BHV3分别接种至MDBK和Vero-E6单层细胞中,培养7d,逐日测定各细胞中的病毒滴度.结果 BPIV3在MDBK细胞中盲传1代即可观察到明显的CPE;在Vero-E6细胞中盲传2、3代可见CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未见CPE.在MDBK细胞中盲传3代可检测到较强荧光信号;在Vero-E6细胞中盲传3代荧光强度较弱;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到荧光信号.BHV3在MDBK和Vero-E6细胞中分别于培养第5和6天时病毒滴度达峰值,分别为1.2×1010和1.0×105 TCID50/ml.结论 BPIV3在MDBK细胞中的复制动力强于Vero-E6细胞,适用于培养该病毒,MRC-5细胞不适用于培养BPIV3.
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风疹单次病毒收获液生产工艺的改进
风疹单次病毒收获液的生产采用人二倍体细胞MRC-5株进行病毒培养,但经MRC-5细胞培养及扩增较困难,使用10 L转瓶培养不易培养致密的单层细胞,生产的单次病毒收获液病毒滴度较低.改用5L转瓶培养,既可培养致密的单层细胞,又可提高单次病毒收获液病毒滴度和单位产量.现将结果报道如下.
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微载体技术高密度培养MRC-5细胞初探
目的 通过探索MRC-5细胞的微载体培养条件,以期建立MRC-5细胞的高密度培养方法.方法 用3种不同培养基(MEM、M199、DMEM)分别培养3.0×104/mL的MRC-5细胞,观察它们的细胞增殖及传代能力；在Spinner培养系统中,用1.0 g/L Cytopore 2和3.0 g/L Cytodex 3分别培养密度为3.70× 105/mL和2.98×105/mL的MRC-5细胞,观察两种载体对细胞生长代谢和细胞密度的影响,筛选出适宜的培养基及微载体.使用5 L CelliGen310生物反应器对筛选获得的培养基及微载体进行MRC-5细胞的灌流培养初步摸索.结果 MRC-5细胞在MEM、M199、DMEM培养基中培养96 h细胞分别增殖了7.0、4.4和3.0倍；在MEM培养基中连续传代至5次以上,细胞增殖稳定,1:3传代72 h形成致密单层,而在M199和DMEM培养基中连续传代均未能获得理想的细胞形态.经96～120 h的培养后,使用1.0 g/L Cytopore 2培养的MRC-5细胞密度达到2.20× 106/mL高于使用3.0 g/L Cytodex 3的1.12×106/mL,且前者葡萄糖和乳酸代谢较后者更为活跃.首选MEM和Cytopore 2作为MRC-5细胞的灌流培养体系.在5L生物反应器中以1.0 g/L Cytopore 2和2.5LMEM培养基培养MRC-5细胞至144h,细胞密度达到1.54×106/mL.结论 初步建立的MEM Cytopore 2微载体细胞培养方法能够获得高密度、活性良好的MRC-5传代细胞.
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三七总皂苷对转化生长因子-β诱导人胚肺成纤维细胞增殖分化及胶原蛋白合成的影响
目的 探讨三七总皂苷对人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖分化及胶原蛋白合成的作用.方法 体外培养人胚肺成纤维细胞MRC-5,随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组和三七总皂苷组.采用四氮唑(MTT)比色法检测转化生长因子-β(TGF-β)刺激的成纤维细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平.结果 与正常对照组比较,模型组MRC-5细胞增殖比显著升高,α-SMA及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平显著升高;地塞米松组和三七总皂苷组MRC-5增殖比较模型组显著降低,α-SMA和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平较模型组显著降低.结论 三七总皂苷可通过抑制MRC-5细胞增殖及分化,抑制人胚肺成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达,从而延缓及阻止肺纤维化.
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银染法检测短串联重复序列(STR)位点PCR产物鉴别MRC-5细胞
通过采用银染法鉴别短串联重复序列聚合酶链式反应(STR)位点的PCR产物来鉴别人二倍体细胞MRC-5株主细胞库、工作细胞库及限制代细胞.运用PCR方法对细胞库的9个STR位点(CSF1PO、TPOX、TH01、F13A01、FESFPS、vWA、D16S539、D7S820、D13S317)和性别鉴别位点Amelogenin进行扩增,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染法显影技术,检测MRC-5主细胞库、工作细胞库及限制代细胞的遗传标记.与ATCC公布的MRC-5的荧光STR图谱的8个STR位点和Amelogenin位点相比,MRC-5主细胞库、工作细胞库、限制代细胞的银染STR图谱的9个STR位点和Amelogenin位点,荧光法和银染法重叠的8个位点(CSF1PO、TPOX、TH01、FESFPS、vWA、D16S539、D7S820、D13S317 和Amelogenin)数据完全吻合,说明细胞鉴别试验成立.STR图谱作为细胞鉴别的方法简单、易行、准确.
