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含当归芍药散简方脑脊液对神经细胞的保护作用
目的:探讨含当归芍药散简方脑脊液的神经保护作用及其可能的机制.方法:采用FeSO4和H202作用产生自由基的方法诱导建立PC12细胞氧化损伤模型,分别用当归芍药散简方(0.135 g·mL-1)ig家兔(1.5 g·kg-1),于1,14 d时取脑脊液添加于培养液中(每组分5％,10％,20％3个体积分数)处理PC12细胞,MTT法铡定细胞活性,硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力,甲基百里香酚蓝(MTB)比色法测定细胞内Ca1+水平,免疫细胞化学法测定α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)阳性表达,BCA蛋白定量及斑点印迹法测定α7nAchR亚单位水平.结果:含20％当归芍药散简方脑脊液对PC12细胞活性(以吸光度表示,A)1 d组(1.241±0.117)和14d组(1.297±0.213)与损伤组(0.986±0.051)比较能明显增加PC12细胞活性(P＜0.05,P＜0.01)、显著提高SOD活力(19.48±0.34),(19.52±0.33)U·mL-1对(18.18±0.12)U·mL-1(P＜0.01),有效降低MDA含量及细胞内Ca2+水平均降低,与损伤组比较P＜0.01；明显上调α7nAChR的表达,14 d组与1d组比较有显著性差异(P＜0.05).结论:当归芍药散简方对FeSO4和H2O2诱导建立PC12细胞氧化损伤模型具有保护作用,其机制与保护α7nAchR有关.
关键词： 老年性痴呆 当归芍药散简方脑脊液 α7nAchR -
α7烟碱型乙酰胆碱受体与炎症的调节作用
在神经系统和非神经胆碱能系统（NNAS）中，α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）表现出良好的稳定性和丰富性，是典型N受体，属于典型介导神经抗炎通路的关键分子。适量的促炎因子有利于激活免疫系统清除病原体，并可促进组织修复；过量的促炎因子则可造成组织损伤。胆碱能神经抗炎通路对炎性反应的调节越来越受到人们的重视，本文主要综述α7nAChR在胆碱能抗炎途径、免疫活性细胞抗炎作用及血管内皮细胞上及抗炎作用。
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α7nAchR 713T＞C突变对阿尔茨海默病小鼠认知功能和tau蛋白磷酸化的影响
目的 研究α7nAchR 713T＞C突变对阿尔茨海默病(AD)小鼠认知功能和tau蛋白磷酸化的影响.方法 3月龄敲除α7nAchR基因的APPSwe小鼠(APPa7KO小鼠)20只,随机分为2组,每组10只,分别在AD小鼠海马注射突变型和野生型7nAchR cDNA,注射后采用Morris水迷宫检测APPa7KO小鼠认知功能的变化,免疫组化方法检测AD小鼠tau(Thr231)表达.结果 与注射野生型7nAchR cDNA小鼠相比,注射突变型7nAchR cDNA小鼠的逃避潜伏期和游泳距离延长,小鼠海马tau(Thr231)阳性细胞数显著增多(P＜0.01).结论 α7nAchR 713T＞C突变加重了AD小鼠的认知功能损害和tau蛋白磷酸化.
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SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号转导通路对α7尼古丁受体蛋白水平的影响
目的 研究p38 MAPK信号传导通路激动及抑制对SH-SY5Y细胞α7神经型乙酰胆碱受体(nAChR)蛋白水平的影响并探讨受体蛋白与p38通路之间的关系.方法 分别用p38 MAPK激活剂Anisomycin和p38 MAPK阻断剂SB203580激动和阻断SH-SY5Y细胞p38 MAPK通路蛋白的活化及其表达,Western印迹方法检测 α7 nAChR蛋白水平.结果 细胞经Anisomycin处理后,p38 MAPK蛋白表达不变,p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平升高了71%(P<0.01),同时细胞α7 nAChR蛋白表达升高了80%(P<0.01).细胞经SB203580处理后,p38 MAPK蛋白表达不变,p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白水平降低了62%(P<0.01),提示p38 MAPK信号通路被抑制,同时细胞 α7 nAChR蛋白表达降低了80%(P<0.01).结论 Anisomycin能激动SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号转导通路,引起α7 nAChR蛋白表达明显增强;SB203580能阻断SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号转导通路,引起α7 nAChR蛋白水平显著降低.
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SH-SY5Y细胞α7尼古丁受体蛋白抑制对tau蛋白及p38MAPK通路的影响及其与AD发病机制的关系
目的 研究α7尼古丁受体(nAChR)蛋白抑制对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化水平的影响及其与p38 MAPK通路的关系,探讨α7 nAChR调节tau蛋白磷酸化的相关机制.方法 用α7 nAChR阻断剂MLA阻断SH-SY5Y细胞α7 nAChR蛋白的活化及其表达,用p38 MAPK阻断剂SB203580阻断SH-SY5Y细胞p38 MAPK信号通路蛋白的活化及其表达,Western blotting方法测定tau蛋白、p-tau(S404)、p-tau(S214)、α7 nAChR、p38 MAPK及p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)蛋白表达水平.结果 细胞经MLA处理后,p-tau(S404)和p-tau(S214)蛋白水平明显升高(P<0.01),p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平明显降低(P<0.01),tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平保持不变;经SB203580处理后,SB203580及MLA共同处理后均引起p-tau(S404)、p-tau(S214)、p-p38 MAPK和α7 nAChR蛋白水平显著降低(P<0.01),tau蛋白和p38 MAPK蛋白水平无变化.结论 α7 nAChR可通过阻断p38 MAPK信号传导通路抑制tau蛋白过度磷酸化.
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α7烟碱型乙酰胆碱受体与炎症调节
由促炎因子介导的炎症反应是机体对感染和损伤的一种防御机制.适量的促炎因子有利于激活免疫系统清除病原体,并可促进组织修复;而过量产生的促炎因子则可造成组织损伤,因此维持炎症反应的平衡十分重要.以往认为体液机制是炎症反应的唯一调节因素,新近发现的胆碱能神经抗炎通路对炎症反应的调节越来越受到人们的重视,而α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)是介导神经抗炎通路的关键分子.本文主要介绍α7nAChR的结构、分布及其介导的抗炎作用机制,并对α7 nAChR激动剂及其临床应用研究和尚待解决的问题予以综述.
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肠神经胶质细胞与体外循环致肠损伤相关性的研究进展
近年来,体外循环术后所引起的肠道功能改变及反映肠损伤的相关炎性介质变化越来越受到人们的关注.当肠屏障发生损害时,将会导致肠道内细菌移位、大量毒素及炎性因子释放,产生系统性炎症反应,进而引起脑、肺、肝、肾等多脏器功能衰竭.肠神经胶质细胞(EGCs)作为肠神经系统的重要组成部分,具有保护肠屏障功能及调节肠神经系统活动的作用.基础研究已证实,肠神经胶质细胞可作为肠屏障功能保护的相应靶点,通过激活EGCs的α7nAchR来减轻肠屏障损伤所致的炎性反应.本文通过对近年体外循环所致肠屏障功能损伤机制和肠神经胶质细胞特点及其相关性的研究进展作一综述,从而为临床寻求防治肠损伤措施提供理论依据.
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α7亚基烟碱能乙酰胆碱受体激动剂后处理减轻大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤佳干预时间的实验研究
目的观察α7亚基烟碱能乙酰胆碱受体（α7 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）激动剂后处理减轻大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，I/RI）的佳干预时间。 方法将60只SD大鼠采用计算机产生随机数法分为6组（每组10只）：假手术组（S组）、缺血/再灌注组（I/R组）、再灌注开始时α7nAChR激动剂后处理组（P0组）、再灌注30、60、90 min时α7nAChR激动剂后处理组（P30组、P60组和P90组）。实验结束测定再灌注180 min时的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、高迁移率族蛋白B1（high mobicity group box l，HMGB1）和肌钙蛋白I(troponinl，TnI)血清浓度，实验取心脏采用伊文蓝和TTC双重染色法测量心肌梗死面积。结果I/R组、P0组、P30组、P60组和P90组的心肌梗死面积值(infarct size，IS％)分别是(78±16)、(60±7)、(49±17)、(54±12)和(64±15)％，并且5组的血清TnI浓度分别是(1.016±0.121)、(0.168±0.037)、(0.156±0.019)、(0.194±0.041)和(0.138±0.029) μg/L。与S组相比，I/R组和P30组的TNF-α血清浓度显著增高，P0组的TNF-α浓度显著降低；I/R组的HMGB1血清浓度显著增高，而全部α7nAChR激动剂后处理组的HMGB1血清浓度显著降低。与I/R组相比，全部α7nAChR激动剂后处理组的IS％显著减小以及TnI、TNF-α和HMGB1血清浓度显著降低。与P0组相比，P30组、P60组和P90组的TNF-α和HMGB1血清浓度显著增高。与P90组相比，P30组IS％显著减小，其TNF-α和HMGB1血清浓度显著增高。 结论在大鼠在体心肌I/RI模型中，再灌注后30 min时进行α7nAChR激动剂后处理可获得佳的心肌保护效应。
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α7 烟碱型乙酰胆碱受体在右美托咪定及褪黑素协同防治大鼠谵妄中的作用
目的 探讨右美托咪定及褪黑素协同防治大鼠谵妄的作用及右美托咪定及褪黑素对α7 烟碱型乙酰胆碱受体(α7AchR)的调节作用.方法 雄性 SD大鼠 30 只,6~8 周龄,随机分为六组:对照组(C组)、东莨菪碱诱导谵妄模型组(S组)、右美托咪定组(D组)、褪黑素组(M组)、α-银环蛇毒素(α-BGT)拮抗组(BM组)和右美托咪定+褪黑素组(DM组),每组 5 只.S组腹腔注射 0.5 %东莨菪碱 1.8 mg/kg建立谵妄大鼠模型;C组用等容量生理盐水代替建模药物;D 组及 DM组于建模前1 5 min腹腔注射右美托咪定40 μg/kg;BM组于建模前1 5 min腹腔注射α-BGT 1 μg/kg;M组、BM组及DM组建模后立即在对侧腹腔注射褪黑素 5 mg/kg.分别于造模前 1 5 min 及造模后 1 0 min进行旷场实验.实验结束后处死大鼠,经内眦取血,采用 ELISA 法检测大鼠血清α7nAchR 浓度.结果 与C组比较,S组周围格路程、旷场总路程明显延长,周围格速度、旷场总速度明显加快(P<0.05);与S组比较,D组、M组、DM组周围格路程、旷场总路程明显缩短,周围格速度、旷场总速度明显减慢(P<0.0 1 ).与D组比较,DM组周围格路程、旷场总路程明显缩短(P<0.05).与 C组比较,S组α7nAChR浓度明显降低(P<0.05);与 S 组比较,D 组α7nAChR 浓度明显升高(P<0.0 1 ).结论 右美托咪定可改善谵妄症状,可能是通过提高α7nAChR 表达.而褪黑素可能增强右美托咪定的谵妄防治效果.
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靶向内皮细胞α7受体的新化合物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响
目的:研究靶向内皮细胞α7受体的新化合物对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的影响.方法:应用鸡胚绒毛尿囊膜模型,通过计数血管的分支点数,观察16种靶向内皮细胞α7受体的新化合物对于在体血管新生的影响.结果与结论:化合物13、14在1～100 μmol·L-1浓度范围内,既没有促进血管新生的作用,也没有抑制血管新生的作用,与生理盐水组相比无显著差异,而在浓度为 1 000 μmol·L-1时,对CAM的血管新生有促进作用.化合物5在浓度为100和 1 000 μmol·L-1有抑制血管新生的作用,而在浓度为1和 10 μmol·L-1时,则对血管新生没有影响.
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糖皮质激素对小胶质细胞内钙的影响
目的 观察糖皮质激素对小胶质细胞内钙的影响并初步探讨其机制.方法 体外培养神经小胶质细胞株BV-2,使用Fluo3-AM作为钙荧光染料,激光共聚焦显微镜实时扫描观察氢化可的松处理后BV-2细胞内钙浓度的动态变化情况.结果 氢化可的松和阳性对照药尼古丁均能显著升高BV-2细胞内钙水平(P<0.05);实时扫描显示氢化可的松即刻引起细胞内钙升高,15 s左右达到峰值,持续约10 s后开始下降,200 s左右恢复至基态,并且这一作用显示出与尼古丁升高细胞内钙效应的一致性.糖皮质激素受体拮抗剂RU486不能取消氢化可的松升高BV-2细胞内钙的效应(P>0.05);而α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)阻断剂甲基牛扁亭碱(MLA)可以拮抗氢化可的松升高BV-2细胞内钙的效应(P<0.05).结论 氢化可的松通过影响α7nAChR升高小胶质细胞内钙水平,这一作用不但证实了糖皮质激素的非基因组效应,同时提示糖皮质激素可能作为α7nAChR的内源性配体.
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α7nAChR的抗炎及神经保护作用研究进展
烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)是配体门控离子通道蛋白,广泛分布于中枢和外周神经系统,在神经元和非神经元细胞中表达,参与各种生理反应.其亚型α7nAChR的抗炎及神经保护作用日益受到关注,被认为是一个潜在的治疗神经系统疾病和炎症的作用靶点.本文总结了α7nAChR在神经系统及非神经系统的分布和表达,在免疫反应中的作用(胆碱能抗炎通路),以及神经保护作用,并指出小胶质细胞α7nAChR可作为抗炎通路治疗靶点.
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大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表达载体及重组腺病毒构建
目的 构建大鼠烟碱样乙酰胆碱受体α7亚型(α7nAchR)基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体.方法 设计并合成编码α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857,并分别与线性化的质粒载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2,pGenesil-1.3连接,以构建可以编码1条α7nAchR基因shRNA和编码2条α7nAchR基因shRNA的重组质粒载体;重组质粒载体感染感受态的DH5a细胞,提取细菌质粒进行特定酶切,并用1%的琼脂糖凝胶电泳以鉴定重组质粒是否构建成功;用LR体外同源重组法将AY318、AY444+559、AY857 shRNA表达框分别从重组质粒pGenesil转移至腺病毒pGSadeno质粒表达载体上,构建重组腺病毒质粒;用相同的方法感染DH5a细胞,并鉴定重组腺病毒pGSadeno质粒是否构建成功;提取线性化的重组腺病毒DNA并转染包装细胞HEK293,经放大培养获得滴度为1.0×1010pfu/mL的重组腺病毒上清;将重组腺病毒感染大鼠GH3垂体瘤细胞,以PCR反应鉴定重组腺病毒载体的α7nAchR基因干扰效果.结果 通过酶切片段及其大小,初步判断AY318、AY857、AY444+559、AY318+857 shRNA成功重组入质粒载体,重组腺病毒pGSadeno-shRNA包装成功;重组腺病毒感染HEK293细胞,在荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;重组腺病毒感染GH3细胞后α7nAchR mRNA表达显著减少,且pGSadeno-AY857 shRNA干扰效果明显(85%).结论 具有感染力和干扰大鼠α7nAchR基因表达的shRNA真核表达载体构建成功,且pGSadeno-AY857 shRNA具有强的基因干扰效果.
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胆碱改善脂多糖诱导的小鼠中枢神经系统炎症反应及认知功能障碍
目的 观察胆碱对脂多糖(LPS)诱导的中枢神经系统(CNS)炎症反应及认知损伤的影响,并对其作用机制进行分析.方法 采用侧脑室注射LPS建立小鼠CNS炎症模型,随机分为生理盐水对照组、LPS组、LPS+胆碱40 mg/kg组、胆碱40 mg/kg组4组.药物干预组和药物对照组胆碱预处理3d,下午12、2和4 pm各1次腹腔注射,对照组和LPS组生理盐水预处理3 d(时间次数同上),胆碱给药贯穿整个实验.观察小鼠自发活动,测定小鼠空间学习和记忆能力.检测海马齿状回IBA-1蛋白表达情况,测定海马TNF-α、IL-1β水平,分析海马α7nAchR、MAPK p38蛋白和磷酸化p38蛋白表达情况.结果 与对照组相比,LPS组小鼠在水迷宫测试中穿台次数明显减少(P＜0.05),胆碱预处理后穿台次数显著上升(P＜0.05);与对照组相比,LPS组小鼠海马IBA-1蛋白(P＜0.0001)、TNF-α(P＜0.001)与IL-1β(P＜0.01)明显升高,胆碱干预后明显降低IBA-1蛋白(P＜0.05)和IL-1β(P＜0.05)的升高,部分抑制TNF-α的升高;LPS处理后p38MAPK磷酸化水平明显升高(P＜0.05),胆碱预处理后显著降低其磷酸化水平(P＜0.05);胆碱干预组α7nAchR表达与其他3组相比显著增高(P＜0.05).结论 胆碱可能通过激活αnAchR来抑制LPS诱导的小鼠海马p38MAPK磷酸化,对LPS诱导的CNS炎症以及认知功能障碍的小鼠具有保护效应.
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青藤碱对肺癌细胞A549中COX2、α7nAChR和A2A表达的影响
[目的]观察青藤碱(sinomenine,SIN)对环氧化酶2(COX2)、α7烟碱型乙酰胆能受体(α7nAChR)和腺苷受体(A2A)表达变化的影响,探讨青藤碱对A549细胞增殖的抑制作用及机制.[方法]采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测青藤碱和4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(NNK)对A549细胞增殖的影响;细胞划痕实验观察青藤碱和NNK对A549细胞迁移的影响;Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞COX2蛋白表达的影响;RT-PCR和Western blot法观察青藤碱和NNK对A549细胞α7nAChR、A2A表达的影响.[结果]NNK能促进增殖和迁移,青藤碱能抑制A549细胞增殖和迁移;NNK组COX2蛋白质水平增加,青藤碱组COX2蛋白质水平下降;NNK组α7nAChR、A2A的表达增加,青藤碱组α7nAChR、A2A表达下降.[结论]青藤碱能通过抑制COX2蛋白表达发挥抗A549细胞增殖和迁移作用;青藤碱对α7nAChR和A2A受体的表达均有抑制作用.
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尼古丁诱导人脐带间充质干细胞凋亡的机制
目的:探讨尼古丁作用人脐带间充质干细胞(MSCs)前后,一氧化氮(NO)、细胞内钙离子(Ca2+)的变化及α7 nAchR的表达情况.方法:采用硝酸还原酶法检测不同质量浓度尼古丁作用于MSCs后24、36、48h,MSCs内NO的释放情况；尼古丁作用MSCs 24 h,fluo - 3/AM染色,流式细胞仪检测MSCs内Ca2+变化；用RT - qPCR检测尼古丁作用后α7 nAchR的表达情况.结果:尼古丁作用MSCs 24、36 h后,各实验组NO水平显著高于对照组(P＜0.05),呈时间、质量浓度依赖性,但在48 h,质量浓度0.8与1.0 mg/mL组,NO水平低于对照组.尼古丁作用后,各实验组质量浓度(0.6、0.8、1.0 mg/mL)的Ca2+荧光强度分别为( 141.26±16.01)、(164.90±18.39)、(198.76±17.63),均高于对照组(119.30±14.14),其中质量浓度0.8、1.0 mg/mL组与对照组相比有显著差异(P＜0.05).MSCs可表达α7 nAchR,且尼古丁作用后表达水平增高,呈时间浓度依赖性.结论:尼古丁可上调人脐带MSCs的α7nAchR表达,并通过刺激MSCs释放NO、升高细胞内Ca2+从而致MSCs凋亡.
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小鼠皮肤切创愈合过程中α7nAChR表达与损伤时间关系
目的 检测皮肤切创愈合过程中α7nAChR的表达及其时间规律性变化.方法 建立小鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术及Western blot方法检测切创后不同时间段皮肤中α7nAChR的表达.结果 免疫组织化学结果显示,对照组t7nAChR表达于表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及真皮中少数的成纤维细胞；伤后6～12h切创皮肤损伤区及周边区可见少量多核粒细胞和单核细胞表达αt7nAChR,1～3d以单核细胞阳性表达为主,5～14d以成纤维细胞为主.α7nAChR阳性细胞率于伤后1d开始升高,伤后7d达高峰,随后逐渐下降.经Western blot检测显示,对照组及各实验组均有α7nAChR阳性条带,其中伤后7d为α7nAChR表达高峰.结论α7nAChR在小鼠皮肤切创愈合过程中呈现一定的时序性变化.
