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中药研发和评价思路与方法探讨
中药复方研发既有中医理论指导,又有长期临床应用经验为依据,显示出独特的价值.同时,中药复方中与临床疗效相关的物质基础复杂多样、作用环节繁多等是中药的特点.现代中药新药发现需要基于中医理论和临床特色,注重整体作用特点和现代生物医学技术密切结合.中药新药研发和评价的关键问题是,用符合中医药临床特点的实验方法学体系来揭示方剂功能主治和证的现代科学内涵.在研发过程中,从立项依据到药效毒理研究均应考虑中药的特点.而且,药效研究应注意加强证候特点的体现,其中证候模型和病症结合模型的研究和应用、方证相应的研究方法、与中药功效相对应地生物学指标的确认等均至关重要.我们要抓住中医药振兴发展的历史机遇,加快中药优势领域药物研发,以大力促进中医药现代化创新进程.
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表证模型研究概况与展望
针对目前中医证候模型研究的整体不足和进展缓慢,立足本课题组对表证方证的几十年研究经验基础上,结合现代科学技术新进展,综合梳理表证模型相关研究,拟在新型表证模型的建立方面寻找新的切入点.通过检索知网、Pubmed等数据库查阅有关表证模型(或上呼吸道感染)的相关文献,按照造模方法进行了较为详细的阐述、分析和总结,展现进展、不足和可能突破口;近年来表证模型在造模方法、方剂反证、方剂研究、生化表征等方面均取得了长足发展,但也存在与临床联系不紧密、方证对应不理想、成模指标不一致、表证评定标准模糊等诸多不足;提出表证病理模型研究应突破原有的思想羁绊,大胆借鉴现代生命科学进展,努力建立多层次的、更加精细的表证病理模型体系.紧密结合临床加强模型研究,充分吸纳生命科学以及其他学科进展,建立多层次更精细的表证病理模型研究系统是目前亟待解决的核心命题,这关乎表证理论、解表方药及其临床实践的深入研究,也是面对日益严重的疫情下人民健康的迫切需求,同时也可为其他证候模型的研究提供借鉴和参考.
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基于有向有环图的慢性胃炎中医虚证症状选择及证候模型构建
目的:探讨有向有环图(DCG)在慢性胃炎中医虚证症状选择及证候模型构建中的可行性.方法:选取脾胃气虚证431例和脾胃虚寒证31例,运用粗糙集(RS)与互信息(MI)方法结合进行特征选择,然后运用DCG进行模型构建.结果:挑选出脾胃气虚证相关症状(体征)19个,脾胃虚寒证相关症状(体征)17个,筛选的相关症状基本与中医理论相符.基于筛选的症状,运用DCG方法构建证候模型,得到两种证候的分类准确率分别为脾胃气虚证74.1％和脾胃虚寒证96.0％,结果均优于朴素贝叶斯网络(NB)方法的72.1％和95.2％.结论:本研究较好地筛选了不同证候的相关症状(体征),应用考虑症状之间关系的DCG方法构建了虚证证候模型,取得了较好的分类效果,值得推广研究.
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基于"方证相关"理论对慢性心力衰竭阳虚证大鼠的初步研究及证型探讨
目的:观察《伤寒论》温阳三方干预心梗后心衰心阳虚证候模型大鼠的药效作用,并探讨该动物证候模型的证候病机.方法:除假手术组外,其余大鼠采用手术结扎冠脉左前降支后第9-12周加用左旋硝基精氨酸腹腔注射的联合造模方法制作心梗后心衰心阳虚证候大鼠,随机分为模型组、桂枝甘草龙骨牡蛎汤组、苓桂术甘汤组、真武汤组,术后9-12周每日分别予0.9％氯化钠溶液和相应药物灌胃治疗.第12周末采用宏观体征与理化指标相结合的方法进行模型动物证候属性判定,血流动力学检测后取材,计算心脏指数.结果:与模型组比较,温阳三方治疗组在一般情况、中医证候指标、心功能、血流动力学及心脏指数上有所好转,其中真武汤、苓桂术甘汤疗效较佳,桂枝甘草龙骨牡蛎汤效果次之;但在存活率方面以苓桂术甘汤为佳.结论:温阳三方(桂枝甘草龙骨牡蛎汤、苓桂术甘汤、真武汤)能有效改善心梗后心衰心阳虚模型大鼠相关证候指标、心功能和左室重构;从综合情况看,根据以方测证,上述证候大鼠在证候上兼有脾阳虚水停之机.
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肝郁-脾虚-肝郁脾虚不同证候模型大鼠水盐及血管调节变化及与疏肝健脾方的作用
目的:探查肝郁、脾虚、肝郁脾虚证模型大鼠水盐及血管调节的功能变化和柴疏四君子汤的影响.方法:大鼠随机分为正常组、肝郁组、肝郁给药组、脾虚组、脾虚给药组、肝郁脾虚组、肝郁脾虚给药组.模型组分别采用慢性束缚、饮食失节+过度疲劳、慢性束缚+饮食失节+过度疲劳的方法,连续造模4周.于造模第15天,分别予柴疏四君子汤3.57g·kg-1·d-1灌胃,连续14d.结果:与正常组比较,3个模型组肾素(PRL2)、血管紧张素(AII)、醛固酮(ALD)升高,心钠素(ANP)降低(P＜0.05,P＜0.01),肝郁脾虚组抗利尿激素(AVP)升高(P＜0.05).与相应模型组比较,肝郁给药组AVP升高(P＜0.05);脾虚给药组ANP升高,ALD降低(P＜0.05);肝郁脾虚给药组PRL2、AII、ALD、AVP降低,ANP升高(P＜0.05).结论:肝郁、脾虚、肝郁脾虚三证模型均存在不同程度的水盐代谢和血管调节异常,柴疏四君子汤对肝郁脾虚证具有较为全面的改善作用.
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调和肝脾方对复合因素致支原体肺炎肝强脾弱大鼠气道反应性的影响
目的:观察调和肝脾中药对模型大鼠气道反应性和相关细胞因子的影响.方法:将40只SD雄性大鼠随机平均分为4组:模型组、空白组、西医组、中药组.采用滴鼻法对实验大鼠进行MP(肺炎支原体)感染,后采用夹尾+冷冻+大黄灌胃多因素复合造成脾虚肝旺证模型;分别给药后,检测各组大鼠血清白细胞介素-4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)含量;以不同浓度乙酰胆碱(Ach)经颈静脉注射刺激大鼠,测量吸气气道阻力(RL)、动态顺应性(Cdyn)及第0.1秒用力呼气容积(FEV0.1)等肺功能指标,反映动物气道反应性.结果:中药组、西医组、空白组分别与模型组比较,IL-4、INF-γ表达显著降低,中药组与西药组比,无显著差异;以较高浓度Ach(0.1、0.2mg/kg)激发大鼠时,中药组、西药组、空白组分别与模型组比较RL更低、Cdyn更高,但是中药组与西药组比较,差异无统计学意义;而FEV0.1则在各个时点,中药组、西药组、空白组较模型组均显著升高.结论:调和肝脾中药在改善肺功能和降低气道高反应性方面和西药作用相当,且具有越高质量浓度Ach刺激,改善作用越为明显的趋势.中药可以纠正INF-γ、IL-4免疫指标失衡,降低Thl及Th2类细胞因子的高表达,而且以降低Th2类因子更为明显.
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心系病证中医证候模型研究进展
中医证候动物模型是开展中医证候实验研究的必要条件,目前已越来越多地应用于中医心系疾病的实验研究,文章从应用概况、动物选择及造模方式对其进行综述.
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制备体质-病-证三位一体动物模型的构想
中医证候动物模型是中医药现代化的关键环节.现有证候模型实现了中医病因病机层面研究的突破,但忽略了体质与病证的相关性,导致了病证的多样化,难以体现中医证候的内涵.本课题组构想体质-病-证三位一体动物模型,通过体质因素和量表的引入,可纯化造模因素、控制病证多样化、量化诊断和评价体系,为中医证侯模型的科学化和标准化开创新的思路和方法.
关键词： 证候模型 体质 构想 体质-病-证三位一体 -
中医证候模型的发展及意义
中医证候模型是研究疾病发生发展及中医药作用机制的有效工具,促进了中医病因病机、辨证论治的深入研究,证候模型的研发和使用是中医药现代化发展的重要环节.本文总结了现有几类证候模型的复制方法及其优缺点,并阐述目前证候模型研究和使用的必要性和意义.
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采用雌性SD大鼠探索建立适宜于气滞血瘀证妇科疾病特点的模型评价体系
目的:建立适宜于气滞血瘀证妇科疾病特点的动物模型评价体系,以临床经典方反证模型证候特点,从宏观生物体征评价模型专属性及可靠性.方法:选用SD雌性大鼠,采用2周皮下注射盐酸肾上腺素及随机昼夜颠倒、冰水游泳、烘箱热烘、噪音刺激、悬尾慢性不可预见性刺激复制模型,灌胃香附四物汤、少腹逐瘀汤及阳性对照药阿司匹林,以血液流变学、凝血4项指标、四诊信息(爪、尾、舌数码拍照；体温检测；体重；摄食量；心电图采集；旷场自主活动)、证候积分综合评价模型.结果:与正常组相比,模型组在血液流变学、凝血4项指标、动物行为学、体重、饮食量、证候积分、心率方面均有明显变化；拍摄舌象、爪像经Photoshop 7.0分析所得大红色(r)、绿色(g)、蓝色(b)的百分含量与正常组相比有显著性差异；阿司匹林及香附四物汤给药组在血液流变学、凝血4项、动物行为学、体重、饮食量、心率、证候积分及舌、尾r,g,b有显著改善作用,而少腹逐瘀汤未见明显改善作用.结论:本文建立了适宜于气滞血瘀证妇科疾病特点的动物模型评价体系,为气滞血瘀证模型评价体系研究提供借鉴.
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偏头痛风湿夹瘀证动物模型的建立
目的:尝试建立偏头痛风湿夹瘀证动物模型.方法:使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型,通过观察动物一般生命体征(活动、体重、眼眵、毛发、进食、大便),挠头次数,图像采集、分析技术研究模型大鼠风湿夹瘀证生物表征(舌象RGB)的变化及动物凝血、五羟色胺等,观察模型动物是否符合风湿夹瘀症候特征.结果:利血平组与利血平加风湿造模组大鼠较对照组凝血时间明显缩短,痛阈降低,全血及脑内5-HT含量明显下降(P＜0.01),利血平加风湿造模组大鼠眼眵增多,活动减少,进食减少,大便稀溏,舌象RGB值分析,对照组大鼠舌象淡红,利血平组舌象紫暗,利血平加风湿组舌质青灰,3组舌象RGB值有明显差异.结论:使用人工气候箱风湿刺激加利血平化低5-HT伴局部脑血管痉挛协同诱导可建立大鼠偏头痛风湿夹瘀证动物模型,但仍需进一步改进造模评价方法与流程.
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血清诱导的肝郁脾虚证细胞模型的建立方法研究
为探索细胞证候模型的建立方法,该研究以人的肝郁脾虚证血清诱导HepG2细胞,建立肝郁脾虚证细胞模型.采用MTT比色法和显微观察法对细胞接种浓度、培养基中人血清含量以及模型细胞生长特性(细胞生长曲线、存活率和表观形态)进行考察.证候细胞模型评价:采用代谢组学手段,分别对正常人血清与肝郁脾虚证血清、正常人血清与肝郁脾虚证血清诱导的细胞模型进行代谢组学分析,得到肝郁脾虚证血清和肝郁脾虚证细胞模型的差异代谢物,对比2个组学得到的生物标记物及其代谢通路,以验证该模型的可靠性和适用性.采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)采集代谢组学数据,对数据进行多元统计分析(PCA,OPLS-DA).结果显示:10％肝郁脾虚证血清诱导下,模型细胞在24～ 72 h内呈现正常生长、缓慢增殖,形态结构稳定的特性;肝郁脾虚证血清和肝郁脾虚证细胞模型具有19个相同的差异代谢物,涉及脂类、氨基酸、核苷酸和能量代谢等9条对维持人体正常生理活动起重要作用的代谢途径.表明所建立的证候细胞模型一定程度上能够反映肝郁脾虚证的生物学基础,为中医证候细胞模型的建立提供了参考方法.
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基于“劳则气耗”理论研究气虚证动物模型的建立方法
该研究根据“劳则气耗”理论,旨在通过比较“神劳”与“体劳”2种因素研究气虚证大鼠模型的建立方法与系统评价体系.分别以水环境睡眠剥夺的“神劳”与以负重力竭游泳的“体劳”为干预因素,按“拟临床研究”的原则建立气虚证动物模型,实验分为正常组、力竭游泳组、睡眠剥夺组与复合组(力竭游泳复合睡眠剥夺),力竭游泳采用负重5％进行,每日1次直至力竭;睡眠剥夺采用水环境多平台睡眠剥夺法,每日随机14 ～ 16 h,复合组则2种方法联合应用,实验周期为6周.采用开场实验观察运动总路程、平均速度、活动时间以及进入中央区域次数,游泳力竭法检测力竭游泳时间,超声心动图检测心功能(LVEF,CO,FS,LVDd),舌象采集分析舌面色彩饱和度,小动物无创脉搏血氧仪测定脉搏幅度,ELISA法检测血清中ATP,ADP含量,血凝仪检测凝血四项.结果显示,睡眠剥夺组自主活动、体质量、运动能力降低明显,神经功能损伤明显,心功能下降,舌面色彩呈现淡白,ATP含量显著降低,ADP显著升高,脉搏幅度显著降低.通过采用“四诊合参”系统评价体系比较“神劳”与“体劳”2种干预因素,以“神劳”为特征的睡眠剥夺方法更适于建立拟临床的气虚证动物模型.
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高血压病中医肝胆湿热证患者血清蛋白质组学研究
目的 对高血压病(hypertensive disease,HD)肝胆湿热证患者血清蛋白质组学进行研究,试图寻找与肝胆湿热证相关的特异蛋白质.方法 选择HD患者60例,其中高血压病肝胆湿热组40例;高血压病非肝胆湿热组20例.另选择健康者39名作为对照.采用弱阳离子纳米磁性微球捕获血清中的蛋白质,ProteinChip PBS Ⅱ-C型蛋白质芯片阅读仪检测绘制成蛋白质质谱(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MS).所有蛋白质质谱采用Biomarker Wizard 3.1分析之后用Biomarker Patterns Software 5.0识别肝胆湿热证特异表达的蛋白质,并建立证候决策模型.结果 HD肝胆湿热证与健康组之间共检测出差异有统计学意义的蛋白质峰182个(P<0.05);肝胆湿热组与非肝胆湿热组之间共检测出差异有统计学意义蛋白质峰132个(P<0.05).经筛选以质荷比为2 761.555(表达增高),6 624.362(表达降低),2 487.192(表达增高),2 461.610(表达增高),2 744.318(表达降低)的5个蛋白峰组成的证候决策模型能很好地将肝胆湿热区分出来,该模型的敏感性为96.55%、特异性为90.00%、假阳性率10.00%、假阴性率3.45%.进一步对此决策模型进行盲法检验(前瞻性考核),结果其敏感性为81.82%、特异性为89.66%、假阳性率10.34%、假阴性率18.18%.结论 差异表达的蛋白质是HD肝胆湿热证的物质基础,以此建立分子生物学证候决策模型.
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从辨证论治的思维特征探索证候分类研究的比较参照体系
从中医辨证论治的思维特征角度出发,通过分析辨证论治的思维过程,疾病、证候、方剂的基本特征,结合现代循证医学的基本原则以及病证结合动物模型的可行途径等方面,探讨建立证候分类研究的比较参照体系.围绕证候病机及其与疾病和方剂的相关性这一中医证候研究的重要科学问题,论述建立以"方剂"治疗效应为比较参照体系的可操作性.坚持突出中医学思维特征与现代科学设计融合的研究思路,以方剂干预治疗效果作为比较参照系统,基于中医以方测证的逆向思维的认"证"方法,不断积累、完善,由此建立具有坚实临床科学基础的证候标准,可能成为当前病证结合、证候研究的有效途径之一.
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卫气虚证大鼠模型的建立及玉屏风散的反证效果
目的 探索卫气虚证动物模型的建立方法并观察玉屏风散对该模型的反证效果.方法 将50只SD大鼠随机分为正常对照组、环磷酰胺组、寒热刺激组、疲劳寒热组、中药干预组,每组10只.正常对照组常规饲养;环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺10 mg/kg,每日1次;寒热刺激组寒热交替刺激造模,每日1次;疲劳寒热组以疲劳联合寒热交替法造模;中药干预组造模方法同疲劳寒热组,每日造模后灌服玉屏风散颗粒25 g/kg,每日1次.各组均连续7天.观察各组大鼠一般情况及行为学表现,判断各造模方法与中医卫气虚证的相似度.比较各组大鼠体重、胸腺、脾脏指数、体外巨噬细胞吞噬功能、脾脏白细胞介素2 (IL-2)、白细胞介素6(IL-6)水平.结果 通过对各组大鼠行为学观察发现,疲劳寒热组大鼠模型更接近中医卫气虚证的宏观证候评定标准.与正常对照组比较,环磷酰胺组、疲劳寒热组、中药干预组大鼠体重显著降低(P＜0.05);与寒热刺激组比较,疲劳寒热组体重显著降低(P＜0.05);与疲劳寒热组比较,中药干预组体重显著升高(P＜0.05).与正常对照组比较,其余各组胸腺、脾脏指数,巨噬细胞吞噬率及吞噬指数,脾脏IL-2、IL-6水平均显著降低(P＜0.05);与疲劳寒热组比较,中药干预组胸腺、脾脏指数,巨噬细胞吞噬率及吞噬指数,脾脏IL-2、IL-6水平均显著升高(P＜0.05).结论 疲劳联合寒热交替法造模是较好的中医卫气虚证大鼠模型造模方法,可被玉屏风散反证.
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肿瘤中医证候动物模型研究的现状概述
自1960年邝安堃首次采用肾上腺皮质激素建立了小鼠阳虚证模型以来,中医动物模型由证候动物模型、疾病动物模型逐步发展到病证动物模型.证是人体在疾病的发生发展过程中具有时相性的本质的反映,即综合分析了各种症状和体征,对于疾病处于一定阶段的病因、病位、病变性质以及邪正双方力量对比各方面情况的病理概括.
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肝郁证雌性大鼠的动情期变化及柴胡疏肝散的防治作用
目的 探查肝郁证雌性大鼠的证候学和动情周期的变化及柴胡疏肝散的防治作用.方法雌性大鼠随机分为正常组,模型组,柴胡疏肝散大、小剂量组,每组10只.肝郁证模型复制采用慢性束缚法.大鼠造模第2周末(造模第14天),柴胡疏肝散大、小剂量组分别给予柴胡疏肝散1.26 g/(kg· d)和0.31 g/(kg· d)灌胃,每日1次,连续2周;模型组和正常组大鼠给予等量蒸馏水.记录造模期间各组大鼠的外观行为和动情周期(阴道涂片法)的变化,实验2周末和4周末做糖水偏嗜实验,实验4周末做旷场实验.结果 模型组大鼠实验期间出现由早期多动兴奋、烦躁易怒逐渐变为扎堆少动,行动迟缓,饮食减少等表现;第2周和第4周糖水偏嗜度分别增加和降低(P<0.01),第4周旷场实验中中央区停留时间、穿格次数、直立次数均降低(P<0.01),出现明显的动情周期紊乱.柴胡疏肝散的防治作用:与模型组比较,柴胡疏肝散大剂量组大鼠外部一般行为的异常趋于适度,糖水偏嗜度增加(P<0.01),旷场实验中的中央区停留时间、穿格次数、直立次数均见增加(P<0.01),动情周期紊乱率明显下降(P<0.01);柴胡疏肝散小剂量组上述指标变化无明显差异(P>0.05).结论 慢性束缚法建立的雌性肝郁模型大鼠不仅表现有中医肝郁证的变化且伴有动情周期的紊乱,肝郁证的治疗代表方柴胡疏肝散对该模型大鼠的中医证候及性周期紊乱均有良好改善作用,且大剂量作用优于小剂量.
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证候模型研究的思路
证候模型作为中医理论和中药研究不可或缺的技术平台一直受到关注.证候模型应该是与生物学和药理学的整体动物模型如生化模型、病理模型、转基因模型和细胞模型等不尽相同的一类生物表征模型,如舌象、唇象、爪象、耳轮、尾尖、眼球、毛皮以及动物行为等表现.这种模型应该符合中医四诊信息所表达的证候表现特征,而不是用想象的某些生物指标来替代.证候模型研究设计应该遵循因-脉-证-治的思路.所谓"因"指造模因素,如寒凝血瘀之寒;所谓"脉"泛指舌脉等临床表现,在这里指模型的体表特征;所谓"证"则是对体表特征所反映的病理机制的概括;所谓"治"指方剂干预效果的反证."脉"应是证候模型评价的较直接、较直观、较重要的指标体系.只有在模型的生物表征符合人体证候的临床表现基础上,才能确认这种模型的证候性质.而"治"的重点是方,以方测证是证候模型验证的一个重要的环节.证候模型在当今中医药理论研究中仍处于探索阶段,尚不能替代人体证候,在证候模型上得出的结论还不能直接解释人体证候有关的问题,证候研究的原则仍应以人体为主.
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对本体论证候和认识论证候的诊断内容及疾病分类学解读
证候是中医现代研究的关键内容,我们把现代医学的病理生理诊断与之对应,并且把证侯学对应于病理生理学,解决了中西医结合的关键理论基础问题.
