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内蒙古中东部地区乳源性大肠埃希菌PCR检测及其耐药性分析
目的 分离牛乳源性大肠埃希菌(E.coli)并进行PCR检测及耐药性分析.方法 根据GenBank上公布的牛源致病性大肠埃希菌基因序列,利用Primer5.0和DNAMAN生物信息学软件,根据该致病菌基因组序列16S～23SrRNA间隔区保守序列设计并合成1对引物,对牛乳中分离的大肠埃希菌进行基因扩增和序列测定,同时利用琼脂平板扩散方法分析阳性菌株的耐药状况.结果 大肠埃希菌基因PCR扩增产物为396 bp,与预期片段大小相符;测序结果与GenBank上公布的牛源大肠埃希菌(X80731.1)基因序列相似性为97.22％,与标准菌株大肠埃希菌(CVCC247)基因序列相似性为100％.分离菌株普遍对卡那霉素、氧氟沙星、氟哌酸高度敏感,对四环素、氨苄青霉素高度耐药.结论 成功分离出牛乳源大肠埃希菌菌株,该组分离菌对四环素和氨苄青霉素高度耐药,为进一步建立牛乳中致病性大肠埃希菌的分子检测方法及指导临床用药提供了依据.
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蛔虫抗菌肽Cecropin P1基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达
目的 设计合成蛔虫抗菌肽基因序列,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,以获得重组蛋白. 方法 根据大肠埃希菌对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性,对蛔虫抗菌肽Cecropin P1编码基因进行改造,人工合成目的 基因,克隆到原核载体PMD-18T,并转化DH5α感受态菌株;构建重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并转化BL21感受态菌株;用双酶切鉴定阳性克隆;含有正确重组质粒的阳性菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物. 结果 PCR扩增及构建的两个重组质粒双酶切鉴定,均获得113 bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE电泳分析显示,含有重组质粒PET-30a-Cecropin P1的阳性菌株在IPTG诱导下高效表达了分子质量单位为3.4 ku的蛋白质.结论成功构建了重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,为进一步研究蛔虫抗菌肽的生物学活性奠定了基础.
关键词： 蛔虫抗菌肽 Cecropin P1基因 原核表达 大肠埃希菌 -
嵌合KGDS基序的蜱抗凝血肽突变体基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达
目的 设计含赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸基序(KGDS)的蜱抗凝血肽(TAP)突变体基因序列,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中与硫氧还蛋白(Trx)融合表达,以获得Trx-TAP-KGDS融合蛋白.方法 人工合成目的 基因,定向克隆于含Trx基因的高效原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-TAP-KGDS,并转化BL21感受态菌,以PCR及双酶切鉴定阳性克隆;含正确重组质粒的工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物. 结果 重组质粒经PCR及双酶切鉴定,均获得约209 bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE分析显示,含重组质粒的工程菌在IPTG的诱导下高效表达分子质量单位约为24 ku的蛋白质,该蛋白以水溶性形式为主. 结论 构建了含KGDS基序的TAP突变基因的原核表达载体pET32a(+)-TAP-KGDS,并成功进行了融合表达,为进一步研究其抗凝血活性打下了基础.
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金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌在不同环境下存活率的比较
目的 用几种不同方法处理细菌,观察对比革兰阳性菌与革兰阴性菌存活率的差异,了解革兰阳性菌和革兰阴性菌的生理特征. 方法 选取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为代表,等比稀释后观察两组细菌A600值的变化情况及与CFU的关系;经过反复冻融、酸碱处理,计数两组细菌CFU,观察两组细菌存活率差异;使用相同浓度的溶壁酶对两组细菌细胞壁进行裂解,观察两组细菌菌体蛋白释放情况. 结果 等比稀释两组细菌,A600值及CFU计数并未按等比下降.在无保护剂的条件下反复冻融3次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有16.14％存活.反复冻融7次后金黄色葡萄球菌全部死亡.在有保护剂的条件下反复冻融5次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有22.09％存活.反复冻融13次后金黄色葡萄球菌全部死亡.在不同pH值培养条件下,金黄色葡萄球菌耐受酸碱变化的范围宽,而大肠埃希菌表现出耐酸的特点.经相同浓度溶壁酶作用后,大肠埃希菌菌体蛋白释放量多于金黄色葡萄球菌.结论 金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌对反复冻融、酸碱及溶壁酶的耐受性不同,可供做细菌学实验时参考.
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盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA△N59的构建及测序分析
目的 构建盆腔炎患者感染大肠埃希菌重组质粒pGEX-SrtA△N59并进行测序鉴定,为寻找盆腔炎患者感染大肠埃希菌的治疗新方法和新药研发奠定基础. 方法 分别提取pMD20-SrtA和pGEX-4T-1质粒并进行鉴定.然后根据SrtA基因序列来设计特异性引物,以pMD20-SrtA为模板进行SrtA△N59基因PCR扩增.将目的片段克隆至pGEX-4T-1中,构建pGEX-SrtA△N59重组质粒,进行酶切和测序分析. 结果 pMD20-SrtA酶切目的基因片段约为618 bp,与预期SrtA基因片段大小相符合,可作为模板扩增SrtA△N59.pGEX-4T-1经单、双酶切均获得5 000 bp片段,大小与预期值(4 900 bp)相符合,该质粒可应用于构建重组质粒.PCR扩增产物约460 bp,与SrtA△N59基因的大小符合.构建的pGEX-SrtA△N59重组质粒经双酶切,获得460 bp目的基因片段,表明SrtA△N59基因成功插到载体pGEX-4T-1中;基因测序显示,其与AF162687基因序列100％匹配.SrtA△N59基因大小应为441 bp,但本实验设计引物时在其两端分别加有酶切位点以及保护性基团,所以所得扩增产物的目的片段大小约为460 bp. 结论 构建的pGEX-SrtA△N59中成功插入SrtA基因,重组质粒构建正确.
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EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr)ompA基因原核表达载体重组构建
目的 构建PThioHisA-ompA重组质粒. 方法 根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析.重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段.再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上. 结果 按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1 kb处有一清晰条带,与预期值相符. 结论 成功构建PThioHisA-ompA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础.
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大肠埃希菌脂多糖脂质体的制备及免疫保护实验
目的 制备临床分离的耐药大肠埃希菌脂多糖(LPS)脂质体并考察其免疫保护作用.方法 采用逆向蒸发法制备大肠埃希菌LPS脂质体,透射电镜观察其形态,激光散射法分析其粒径分布,鲎试验法(LAL)测定其活性;用LPS脂质体免疫小鼠,以LPS 2倍完全致死剂量攻击小鼠,观察并记录结果. 结果 大肠埃希菌LPS脂质体常温下呈乳白色混悬液,透射电镜下呈多层圆形或椭圆形小囊,粒径为(300.195±108.932)nm;LAL法测定E. coli LPS脂质体和E. coli ob55∶b5 LPS脂质体活性,均比未经脂质体包被的LPS降低99.9%;E. coli LPS脂质体和E.coli ob55∶b5 LPS脂质体免疫鼠接受E. coli LPS攻击后72 h的存活率分别为91.67%和75.00%,与对照组存活率16.67%比较,差异均有统计学意义(P=0.000 322和P=0.000 614). 结论 大肠埃希菌LPS脂质体制备方法可行,制备的LPS脂质体对该菌属的LPS攻击均具有一定的免疫保护作用.
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日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达
目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达. 方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定. 结果RT-PCR扩增出1 270 bp的Sja2基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42 ku的莺组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别. 结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性.
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大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性和耐药质粒谱分析
目的 研究大肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella peumoniae)临床分离株耐药性及其质粒谱变化.方法 对福建医科大学2所附属医院分离的E.coli和K.peumoniae共53株行药敏试验.检出产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的菌株用碱变性法提取质粒,采用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析质粒谱.结果 产ESBLs菌株对多数青霉素和头孢菌素类抗生素耐药.对碳青霉烯类和酶抑制剂敏感(P<0.05).不产ESBLs E.coli菌对喹诺酮类的敏感性高于产酶菌株(P<0.01).受检菌株对丁胺卡那霉素的敏感性较高.产ESBLs菌株60.0%检出质粒,其中50%携带0.9 kb质粒.对环丙沙星耐药的E.coli,50%携带4.2 kb质粒;4株对丁胺卡那霉素耐药的E.coli中,2株携带9.4kb质粒.结论 E.coli和K.peumoniae产ESBLs主要由质粒介导.0.9 kb质粒可能与产ESBLs有关;4.2 kb的质粒可能与环丙沙星耐药有关;9.4 kb质粒可能与丁胺卡那霉素耐药有关.
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产ESBLs大肠埃希菌耐药性及基因型分析
目的 了解川南地区医院感染产β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌基因型特征和临床耐药情况. 方法 收集2010年10月～2011年9月期间本院住院患者分离的大肠埃希菌,双纸片协同试验确定产ESBLs大肠埃希菌,PCR扩增技术进行基因分型,K-B法比较产ESBLs阳性株与阴性株耐药率. 结果 77株大肠埃希菌双纸片协同试验确认28为株产ESBLs菌株；PCR扩增显示,28株产ESBLs大肠埃希菌中TEM型11株(39.29％),SHV型6株(21.43％),TEM、SHV双基因型2株(7.14％),非TEM、非SHV型9株(32.14％).K-B法测定ESBLs阳性株对多种抗生素的耐药率(亚胺培南除外)高于ESBLs阴性株. 结论 川南地区产ESBLs大肠埃希菌以TEM型为主,对常用抗菌药物耐药率高于ESBLs阴性菌株.
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细粒棘球绦虫Eg95抗原编码基因在BCG中的表达效率研究
目的探讨细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中的表达, 为囊型包虫病疫苗的开发利用提供依据. 方法用热诱导方法诱导rBCG-Eg95疫苗,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白. 结果表达重组蛋白为可溶性蛋白,分子质量单位为16.5 ku.Western blot示重组蛋白具有抗原性, 用薄层扫描Bio-Rad Quantity one分析系统分析,表达效率为占BCG 菌体总蛋白的12%. 结论细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中成功表达,为BCG发展为多价疫苗载体奠定了基础.
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CTXM-15型大肠埃希菌的分子分布特征及质粒传播规律研究
目的 探讨CTX-M-15型大肠埃希菌的分子分布特征及质粒传播规律. 方法 232株CTX-M-15型大肠埃希菌鸟枪法测序序列从GenBank数据库获取,利用CGE在线工具获得菌株的MLST分型、耐药基因及质粒类型信息,应用eBURST软件绘制MLST分型结果聚类图. 结果 232株CTX-M-15型大肠埃希菌共检测出 37个MLST型别,其中以ST131菌株检出率较高,为35.34％(82/232).菌株中耐药基因数目为1～22个不等,出现耐药基因数目较多菌株的ST型别为ST131和ST617,其中blaOXA-1、aac(6') Ib-cr、aac(3)-Ⅱ、aadA、mph(A)等7种耐药基因在ST131菌株和非ST131菌株中的分布差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),且ST131菌株检出率高于非ST131菌株(P＜0.05或P＜0.01).菌株巾检测到blaOXA48、blaKPC2、HaNDM1、blaCMy、blaVIM等其他类型的β-内酰胺类耐药基因,主要的β内酰胺基因组合形式是blaTEM1+blaCTXM15,而在ST131中主要的组合形式是blaOXA1+blaCTX-M-14(32/82).检测到的不相容性质粒的类型有9种,其中IncF型质粒的检出率较高,为95.26％(221/232),该质粒在ST131菌株中的检出率为98.78％(81/82).菌株中IncF型复制子类型出现频率较高的是IncFIA+IncFIB+IncFII(83/232),在ST131菌株中上述复制子中检出率较高的是IncFIA+IncFII,为51.22％(42/82).IncF型质粒经pMLST分型可获得59种型别,F36:A4:B1、F31:A4:B1、F48:A1:B49型质粒主要存在于ST131菌株和CC10克隆复合体巾,而ST131菌株中主要的质粒类型是F2:A1:B-(38/82). 结论 CTX-M-15型耐药基因主要存在于ST131型别的大肠埃希菌株中,ST131菌株比其他菌株具有更强的适应能力,同种型别的质粒可以在亲缘关系相近的菌株之间传播.
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铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达
目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法 扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1入T,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western b1ot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果 一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别.结论 成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性.
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微波与食醋协同杀菌作用的试验观察与研究
目的 了解微波与食醋协同杀菌作用效果.方法 采用细菌悬液定量杀菌试验和模拟现场试验等方法进行微波与食醋协同杀菌试验观察.结果 320 W、2 450 MHZ微波与醋酸含量3 000 mg/L食醋协同作用6 min,对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭对数值均＞5.00;与醋酸含量15 000 mg/L食醋协同作用6 min,对白色念珠菌的杀灭对数值＞5.00;单用320 W、2 450 MHZ微波6 min对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的杀灭对数值分别为4.66、4.12、4.56;单用醋酸含量5 000 mg/L的食醋6 min对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值分别为4.45、3.85;单用醋酸含量20 000 mg/L食醋6 min对白色念珠菌的杀灭对数值为4.05.650 W、2 450 MHZ微波与醋酸含量40 000 mg/L食醋协同作用12 min,对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭对数值＞5.00;单用650 W、2 450 MHZ微波12 min的杀灭对数值为4.22;单用醋酸含量50 000 mg/L食醋3 h的杀灭对数值为3.95.320 W、2 450 MHZ微波与醋酸含量3 000 mg/L食醋协同作用6 min,对竹筷表面大肠埃希菌平均杀灭对数值＞3.00;650 W、2 450 MHZ微波与醋酸含量40 000 mg/L食醋协同作用12 min,对医用止血钳表面的枯草杆菌黑色变种芽孢平均杀灭对数值＞3.00.小牛血清可使微波与食醋协同杀菌作用效果下降.结论 微波与食醋对细菌具有明显的协同杀灭作用,可用于饮食器具及医疗器械消毒.
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多房棘球绦虫重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)表达效率的研究
目的 研究多房棘球绦虫(Em)重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率.方法 通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定.结果 PCR成功扩增出2 554 bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因插入pGEX-1λT中,成功构建了pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3重组质粒;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了能被活动性泡球蚴病鼠血清识别的EmⅡ/3-Em14-3-3/GST融合蛋白,分子质量单位119 ku.结论 多房棘球绦虫EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达出的EmⅡ/3-Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性.
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泌尿生殖道大肠埃希菌感染男性不育患者精浆NO、MDA和SOD含量的变化
目的 探讨泌尿生殖道大肠埃希菌感染的男性不育患者精浆一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和过氧化物歧化酶(SOD)水平变化对生精细胞的影响.方法 60例泌尿生殖道大肠埃希菌感染男性不育患者(A组)、30例无感染不育患者(B组)和有正常生育能力的健康男性30例(C组),采用硝酸还原酶法测定精浆NO的含量,硫代巴比妥酸比色法测定精浆MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定精浆SOD的活力.选择大肠埃希菌感染不育组中精浆MDA含量>17μmol/L 30例,精浆MDA的含量在7～9 μmol/L之间的正常生育的健康男性20例,测定精子的各项运动参数并进行比较.结果 A、B、C组精浆中NO含晕分别为(137.64±25.87)、(117.17±27.72)和(66.88±20.51)μmol/L,MDA含量分别为(18.44±4.06)、(10.50±2.33)和(7.62±1.52)nmol/ml,SOD活力分别为(93.93±18.93)、(126.71±25.63)和(195.66.±19.26)μmol/L,A组与C组及B组与C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01).MDA含量升高主要影响精子直线速度、前向性运动率.其次为平均移动角度、侧摆幅度、直线性百分率.经相关分析,感染性不育患者精浆MDA的含量与NO含量呈正相关(r=0.63),与SOD活力呈负相关(r=0.69).结论 泌尿生殖道大肠埃希菌感染男性不育患者精浆NO、MDA含量及SOD活力异常可能是导致男性不育的原因之一.
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乙肝病毒PreS2基因在大肠埃希菌中的表达
目的 在大肠埃希菌( Escherichia coli )中表达乙肝病毒前S2(HBV PreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化.方法 利用DNA重组技术,将全长的HBV PreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至 E.coli ,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的 蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Western blot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白.结果 成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的 蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达.纯化产物能与anti-Hepatitis B virus PreS2 Antigen发生特异性反应.融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白.结论 在 E. coli 中成功表达了HBV PreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础.
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结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究
目的 构建结核分枝杆菌(MTB)重组质粒pGEX-ESAT-6,分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率. 方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的高效原核表达载体pGEX-1λT,经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定. 结果 PCR扩增出288 bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中,构建了pGEX-ESAT-6穿梭表达载体.SDS-PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35 ku,表达效率为20%,Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别. 结论 结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达,表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性.
关键词： 分枝杆菌 结核 重组质粒pGEX-ESAT-6 大肠埃希菌 表达效率 -
乙型肝炎病毒剪接蛋白在大肠埃希菌中的表达和纯化
目的 高效表达并获得高纯度的乙型肝炎病毒剪接蛋白(hepatitis B splicing protein,HBSP).方法 将HBSP编码基因克隆人原核表达载体pET43.1a(+),并在目的基因的C端引入StrepⅡ标签的编码序列,构建HRSP表达载体；将StrepⅡ标签的编码序列置于HBSP基因片段的N端,同时在StrepⅡ和HBSP之间引入终止密码子以构建对照载体.将以上质粒分别转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),以IPTG诱导,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达及其可溶性；通过Strep-Tactin系统亲和层析纯化蛋白,Western blot检测其反应原性.结果 成功构建HBSP重组表达载体pET-43-HBSP-StrepⅡ及对照载体pET-43-StrepⅡ,经IPTG诱导后,分别在大肠埃希菌中高表达Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶形式存在于细菌裂解上清液中.通过亲和层析获得纯度超过95％的Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,两融合蛋白均能被Strep· TagⅡ单抗识别.结论 在大肠埃希菌中可高效、可溶性表达并获得高纯度的HBSP融合蛋白及对照蛋白,为HBSP功能研究打下良好基础.
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大肠埃希菌基因间重复序列PCR反应体系的优化
目的 对大肠埃希菌ERIC-PCR反应体系进行优化. 方法 提取大肠埃希菌基大组DNA作为ERIC-PCR反应的模板,通过设计一个L9(34)正交试验对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶4种因素进行优化. 结果 通过L9(34)正交试验优化的大肠埃希菌ERIC-PCR佳反应体系(25μl)为:2.5μl 10×Loading buffer,Mg2+浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200 μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,模板DNA 40 ng.应用该体系进行ERIC-PCR得到的DNA指纹图谱条带丰富、清晰、重复性好. 结论 采用正交试验优化的ERIC-PCR反应体系结果稳定可靠,对于大肠埃希菌在分子水平上的分型鉴定以及分子流行病学调查具有重要意义.
