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4种ELISA方法检测牛口蹄疫非结构蛋白抗体的ROC评价
目的 比较4种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体(FMDV-NSP)ELISA的临床检测效果.方法 以Ceditest ELISA试剂盒检测结果为"金标准",应用4种ELISA方法检测164份牛血清口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,通过平行试验比较各检测方法的特异性,敏感性及检出率,然后应用受试者工作特征(ROC)曲线分析,分析各检测方法的Youden指数,并优化适临界值,再次比较几种检测方法的特异性,敏感性及检出率.结果 口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测ELISA试剂盒,口蹄疫病毒非结构蛋白抗体单抗阻断ELISA试剂盒,3B合成肽ELISA试剂盒和本实验室建立的8BF-ELISA的敏感性分别为94.2%(80/85),91.9%(78/85),83.7%(71/85),91.9%(78/85);特异性分别为97.4%(77/79),91.0%(72/79),97.4%(77/79),94.9%(75/79);检出率为95.8%(157/164),91.5%(150/164),90.3%(148/164),93.3%(153/164)..经X2检验,4种ELISA的检出率之间无显著性差异(P=0.461>0.05).但3B合成肽ELISA试剂盒的敏感性明显低于其他3种检测方法,不适合大规模临床样本的初筛试验.结论 在优化临界值后的ELISA A,ELISA B和ELISA D的敏感性和特异性都大于90%,同时有着很高的检出率,均可用于大规模临床的样本的初筛试验.
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西尼罗河病毒NS1的克隆、表达及抗原性分析
目的 克隆和表达西尼罗河病毒(WNV)非结构蛋白1(NS1),并分析其与登革病毒NS1的抗原交叉反应性.方法 合成WNV NS1全基因序列,将NS1全基因克隆到pGEX-5X-3原核表达载体中表达GST-NS1融合蛋白,用4型登革病毒免疫血清及登革病毒NS1单克隆抗体并应用Western Blot方法 分析WNV-NS1重组蛋白的抗原性.结果 重组质粒pGEX-5X-3-WNV-NS1经IPTG诱导,高效表达GST-NS1融合蛋白,经变性纯化和复性获得可溶性WNV-NS1重组蛋白,经Western Blot证实WNV-NS1重组蛋白可与各型登革病毒免疫小鼠血清及部分4型登革病毒NS1交叉单抗识别.结论 成功获得可溶性WNV-NS1重组蛋白,该蛋白与登革病毒NS1具有抗原交叉反应性,其结果 为建立西尼罗河病毒的血清学诊断和鉴别诊断奠定了基础.
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Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究
目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性.方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36 细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定.结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别.结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达.纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础.
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II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
目的 获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原.方法 RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1.并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1.在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1.rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白.结果 成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性.结论 II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础.
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口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因在毕赤酵母中的表达
目的 利用毕赤酵母系统表达口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB,用于FMDV感染与疫苗免疫动物的鉴别诊断和3AB蛋白功能研究.方法 采用PCR方法从Pgem-T-Easy-3ABC质粒中扩增3AB基因,将其插入pPICZαA酵母表达载体中,构建的重组表达质粒线性化后电转入毕赤酵母GS115中,在0.5%甲醇诱导下表达3AB蛋白,运用SDS-PAGE和ELISA方法鉴定表达蛋白.结果 成功构建了pPICZαA-3AB重组酵母表达质粒,并转化入毕赤酵母GS115中,SDS-PAGE和ELISA鉴定结果表明,重组酵母菌株表达出约19kD的3AB蛋白,与针对FMDV的3AB蛋白单克隆抗体有特异性反应.结论 在毕赤酵母中成功表达了FMDV 3AB蛋白,与抗FMDV 3AB蛋白单克隆抗体具有反应性.
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口蹄疫病毒非结构蛋白3Dpol的研究进展
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病.FMD是OIE规定的A类动物疫病之一,严重影响畜牧业的发展,对世界公共卫生存在着巨大影响,造成巨大的经济损失,素有"政治经济病"之称.FMD的致病原是小RNA病毒科,口蹄疫病毒属成员,于1897年首次确定.FMDV是正链RNA分子,长约8 500 bp,包裹于由60个拷贝的4种病毒结构蛋白VP1-4构成的二十面体的衣壳中.
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A组轮状病毒蛋白研究进展
轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种重要的人兽共患病原,引起各种幼龄动物腹泻,在世界范围内造成严重的经济损失.RV属呼肠病毒(Reoviridae)科,轮状病毒属,为双链RNA病毒,其基因组不连续,由11个节段(Segment)的双链RNA组成,每个节段编码一种蛋白质,分为结构蛋白和非结构蛋白.
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A型流感病毒NS1蛋白抑制IFN抗病毒作用的机制
A型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)是引起人类呼吸道传染病流行和畜禽死亡的主要病原.干扰素系统是人体重要的病毒防御体系.病毒感染宿主后,干扰素-α/β(interferon-α/β,IFN-α/β)基因去抑制而表达,然后启动IFN调控基因的表达,生成多种作用于病毒的酶和蛋白质,从而使机体在数分钟内处于抗病毒状态.研究表明,在IAV基因组第8节段编码的约26kDa的非结构蛋白(the non-structural protein 1,NS1蛋白)对IFN-α/β的抑制作用是IAV阻断宿主表达IFN-α/β进而突破机体防御系统的主要原因[1].本文就NS1蛋白抑制IFN-α/β抗病毒作用的机制作一综述.
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登革病毒重组蛋白表达及其亚单位疫苗研究进展
登革病毒(DV)为黄病毒属的重要成员,借蚊媒传播而引起登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS),其基因组全长约为10.7kb,编码有C-prM/M-E3个结构蛋白和7个非结构蛋白.
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黄病毒嵌合疫苗研究进展
黄病毒(Flaviviridae)是一类具有抗原交叉反应性的病毒总称,其基因组为约11kb长的单正链RNA分子,只含有一个ORF,编码有C-prM/M-E结构蛋白和NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5非结构蛋白.大多数黄病毒通过吸血节肢动物叮咬易感脊椎动物而传播,主要引起人类疾病的有黄热病病毒(YFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、登革病毒(DV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)等,虽然YFV、JEV的减毒活疫苗已推广应用,但TBEV灭活疫苗效果尚不可靠,而安全有效的DV疫苗尚未研制成功,因此积极研制包括4个型DV在内的黄病毒减毒活疫苗是今后的发展方向.自1991年Bray等学者[8]首先构建DV嵌合疫苗以来,黄病毒嵌合疫苗的研究取得重大进展,成为人类预防和控制黄病毒感染的重要手段,本文概括了其发展状况.
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肠道病毒非结构蛋白功能的研究进展
肠道病毒是一类主要经消化道传播的病毒,可引起人类多种疾病.随着对肠道病毒研究的深入,发现肠道病毒的非结构蛋白在病毒增殖和宿主致病过程中发挥着重要作用,该文就肠道病毒非结构蛋白功能研究进展进行综述.
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丙型肝炎病毒结构蛋白与非结构蛋白的研究进展
丙型肝炎病毒（HCV）结构蛋白包括核心蛋白和2个包膜糖蛋白，即包膜糖蛋白 E1和包膜糖蛋白 E2；非结构蛋白包括 NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。结构蛋白主要在病毒颗粒侵入与组装中发挥作用。非结构蛋白与感染细胞蛋白相互作用，在病毒的复制以及病毒致病过程起关键作用。
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肠道病毒71型微复制子的构建
目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况.方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系.荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况.结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12 ～72 h取样所测RNA含量几乎不变.结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义.
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H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因的克隆及原核表达
目的:为防控禽流感在家禽和水禽中的流行,从而控制对人的感染,探讨一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊断方法.方法:采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的NS1基因(660 bp);并将该片段克隆至pET-28(a)质粒中,构建重组表达载体pET-NS1,转化E.coli BL 21(DE3)感受态细胞,以终浓度0.7 mmol/L的IPTG诱导表达6 h,并应用Western-blot方法分析表达产物的反应原性.结果:pET-NS1载体能高效表达NS1蛋白,相对分子质量约25 000,纯化产物能与该亚型的AIV活病毒感染鸡血清发生特异性反应而与灭活病毒免疫鸡血清不发生反应.结论:NS1基因在大肠埃希氏菌中的表达产物可用来鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群.
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轮状病毒非结构蛋白的研究进展
轮状病毒非结构蛋白(NSP)对轮状病毒的致病性口益得到重视.现就NSPI对干扰素调节因子的调节作用、NSP2的免疫性、NSP4对细胞钙稳态的影响及NSP5磷酸化的研究进行综述.
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非结构蛋白P48和P22在诺如病毒感染中的作用
诺如病毒（norovirus， Nov）属于人类杯状病毒科，是引起病毒性腹泻的主要病原之一。诺如病毒非结构蛋白P48可能与高尔基体有相互作用，破坏蛋白质的运输。而非结构蛋白P22能抑制细胞的蛋白分泌。这些研究对了解诺如病毒复制和致病机理奠定基础，同时也为抗病毒的药物开发提供方向。
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柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备
目的 表达和纯化柯萨奇病毒(CVB5)非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1:500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.
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口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus , FMDV)非结构蛋白(NSP)-3ABC可用于注苗与感染动物的鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5' 端和3' 端分别加入含BamH I和Hind III限制性酶切位点序列.以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5α.提取重组载体pT-3ABC,经BamH I/Hind III双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了NSP-3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应.ELISA试验结果显示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断.
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口蹄疫病毒非结构蛋白P3区的基因序列及分析
以口蹄疫Akesu/58分离株的53代牛舌皮病料为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了两个约1.5kb的DNA片段.核酸序列测得结果对接后,涵盖了全部P3区的基因序列.口蹄疫Akesu/58分离株基因组P3区的核酸序列共计2,724nt,包括一个终止密码子TAA,共编码907个氨基酸;其中非结构蛋白3A的基因是459nt,编码153个氨基酸;3个3B(VPg)基因分别是69、72和72nt,氨基酸分别为23、24和24;3C是639nt,213个氨基酸;3D是1,413nt,471个氨基酸.各蛋白间由Glu/Gly(Ser)连接.序列比较显示:3A的C端易变,其它区的变易呈零星散在.
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H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白(NS1)基因的克隆与表达
由于H9N2亚型禽流感对我国的养鸡业已造成了很大的损失,因而在我国许多养鸡场不得不使用H9N2亚型禽流感灭活苗[1],但由于灭活苗的使用,而增加了H9N2亚型禽流感的监测难度.因此,建立一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊断方法已被提到日程上来.
