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荧光定量聚合酶链反应技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA的可行性研究
目的:探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术用于孕妇外周血浆中游离胎儿DNA检测的可行性.方法:利用FQ-PCR技术特异性扩增Y基因性别决定区(SRY)并定量分析妊娠中期(18～25周)孕妇血浆中含量.结果:148例男胎孕妇血浆标本中,SRY基因检出率为98.65%.139例女胎孕妇血浆标本中未检测到SRY基因.结论:FQ-PCR技术在孕妇外周血游离胎儿DNA的检测中具有较高的灵敏性和特异性,FQ-PCR技术可应用于非创伤性产前诊断.
关键词： 胎儿DNA 荧光定量聚合酶链反应 非创伤性产前诊断 -
无创产前基因检测在胎儿染色体非整倍体筛查中的应用
目的 评估无创产前基因检测技术(noninvasive prenatal testing,NIPT)在胎儿染色体非整倍体产前筛查与诊断中的临床应用价值.方法 针对2012年5月至2013年4月在杭州市第一人民医院集团产前诊断中心就诊的高龄、唐氏生化筛查高风险和中等风险孕妇,采用高通量大规模平行测序方法进行胎儿染色体非整倍体的无创产前检测.对检测结果为高风险者进一步进行染色体核型分析,对检测结果为低风险的孕妇随访妊娠结局,评估NIPT对染色体非整倍体检测的敏感性和特异性.结果 2 358例检测孕妇中,高风险23例,染色体核型分析结果显示,NIPT检测21三体、18三体的敏感性为100％,检测13三体的敏感性为0.2 335例低风险妊娠结局随访,B超检查胎儿结构异常7例,未发现21三体综合征患儿出生.结论 NIPT对21三体、18三体综合征检测具有较高的敏感性和特异性.NIPT作为唐氏筛查的一种常规补充手段,可避免95％以上的唐氏生化筛查假阳性病例进行有创性的产前诊断.
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孕妇血浆中胎儿DNA的检测
从孕妇外周血中分离胎儿细胞一直是遗传病非损伤性产前诊断的主要思路与探索途径.尽管在孕妇外周血中胎儿细胞的富集,鉴定,和遗传病的非损伤性产前诊断等方面取得了一些重要的进展,但是利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行遗传病非损伤性产前诊断的主要障碍依然是胎儿细胞的富集效率不高,而过高的的母体背景影响检测胎儿特异等位基因.近发现在孕妇的血浆中存在胎儿DNA,这一发现为非损伤性产前基因诊断开辟了新途径.我们结合煮沸法与硅法,建立了一种有效的,简便的,经济的从血浆中提取DNA的方法,通过调整PCR系统组成,增加循环次数,成功地从母体血浆中扩增出胎儿特异的SRY基因,同时采取严格的防污染措施,避免了假阳性或假阴性结果.我们的结果表明,应用我们建立的血浆DNA提取方法与调整的PCR系统,在孕早期可以准确地确定胎儿的性别,这对于性连锁疾病的非损伤性产前诊断具有重要意义.我们的工作为我国非损伤性产前诊断研究的开展与深入打下基础.
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孕妇外周血中游离DNA分级分离方法的应用研究
目的探讨DNA片段差异性分级分离法对孕妇血浆中胎儿游离DNA富集的效果.方法取孕中期孕妇静脉血5 ml,分别提取血浆中游离DNA和白细胞DNA,用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,回收<400、400～1 000、1 000～3 000 bp部分凝胶中的DNA,扩增16个短串联重复序列(STR)遗传标志位点,同时扩增和检测孕妇白细胞基因组DNA和胎儿羊水细胞基因组DNA作对照,然后,用ABI 310基因分析仪检测.结果共检测3例孕妇外周血标本48个STR位点,其中有意义位点(即胎儿父源性等位基因可与孕妇等位基因区分的STR位点)31个.从血浆总DNA、<400、400～1 000和1 000～3 000 bp DNA组中成功检测到胎儿等位基因的位点数占有意义位点数的百分比分别为6.45%、29.03%、38.71%和9.68%,各组检出成功率的差异有统计学意义(χ2=13.432,P=0.004),而＜400和400～1 000 bp DNA组成功率较高. 结论孕妇血浆DNA中短片段组分(<1 000 bp)胎儿DNA含量相对较高,有望应用于无创性胎儿产前诊断.
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从孕妇血浆中提取胎儿DNA鉴定胎儿RhCcEe血型
目的探讨利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe血型的方法.方法采用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA,利用SRY基因确认胎儿DNA的存在,通过PCR方法扩增30例孕妇血浆中胎儿DNA以检测胎儿RhCcEe基因,并对产前孕妇外周血和产后婴儿外周血进行RhCcEe血清学表型分析,回顾性评价胎儿基因分型结果的准确性.结果 30例样本中,13例母子表型完全相同,17例存在区别.当母亲表型为RhCC、cc、EE、ee纯合子时,均成功扩增出母亲所缺少的c、C、e、E基因.结论本研究建立的非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe基因型的方法是可行的,当母亲为纯合子时,血浆中胎儿RhCcEe基因分型具有临床意义,可用于新生儿溶血病的预防和诊断.
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ERG甲基化作为无创产前诊断唐氏综合征标记的可行性研究
目的 探讨ERG基因是否可以作为孕早期血浆中检测胎儿DNA的通用标志物.方法 随机选择早期妊娠孕妇70例,并以经体检确定为未孕健康妇女70例、分娩过21-三体胎儿的妇女11例和顺产后3 d妇女20例作为对照组.利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ、MspⅠ酶切后进行常规PCR的方法,检测血细胞、绒毛和血浆DNA目的 基因ERG 21-128序列的甲基化模式,并对妊娠组和对照组样本进行统计学分析.结果 位于21号染色体上的ERG基因21-128序列在70例孕8、9、10周孕妇绒毛组织中甲基化而在母体血细胞中未甲基化,绒毛甲基化检出率为100%;在血浆中游离胎儿DNA ERG基因21-128序列的甲基化检出率为77.1%,敏感度为77.1%.其中8、9、10周甲基化差异无统计学意义(P>0.05).在70例未孕健康妇女、11例生产过21三体胎儿的健康妇女和20例产后3 d妇女的对照组的血浆中ERG 21-128序列均未甲基化.结论 在母体和胎儿DNA中,ERG基因21-128区的甲基化有显著性差异,实验方法也比较简单,提示了ERG是无创性产前诊断DS的一个潜在标记物.
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STR-PCR检测孕妇外周血浆中胎儿DNA基因型的初步研究
目的采用短串联重复序列(STR)多态位点的复合扩增方法,研究孕妇血浆中胎儿DNA基因型.方法采用STR多态位点即CSF1PO、TPOX、TH01(简称CTT)三个位点的复合扩增方法,对30例孕妇孕中期的血浆DNA进行扩增,并对扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后观察结果.结果30例孕中期的孕妇中,16例从母体血浆中检出了父源性等位基因,5例可能检出了胎儿DNA,3例未检出胎儿DNA,6例扩增失败.结论STR多态位点的复合扩增,判断基因型简便、快速,结果容易判断,费用低,可用于父源性遗传病的产前诊断.
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孕妇血浆胎儿DNA的父源性α地中海贫血产前基因诊断
目的 检测孕妇血浆胎儿DNA的父源性东南亚缺失型α地中海贫血1(SEAα地贫1)基因突变,进行无创伤性产前基因诊断.方法 应用荧光聚合酶链反应(PCR)和基因扫描方法分析10例孕妇血浆胎儿DNA的父源性SEAα地贫1基因突变及短串联重复序列(STR);同时以常规的绒毛、羊水或脐血胎儿DNA的基因诊断结果作对照.结果 10例孕妇血浆胎儿DNA均检测到父源性STR等位基因.有4例检出父源性SEAα地贫1基因突变;6例未检出父源性SEAα地贫1基因突变,与常规的绒毛、羊水或脐血胎儿DNA的产前基因诊断结果一致.结论 应用荧光PCR和基因扫描方法检测孕妇血浆胎儿DNA的父源性SEAα地贫1基因突变,可排除血红蛋白H病胎儿.
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母体血浆或血清中胎儿DNA在产科领域应用的新进展
母体血浆或血清中存在高浓度的胎儿DNA,用PCR方法检测母血中的胎儿DNA有望成为非创伤性产前诊断方法,用于筛查某些遗传性疾病以及某些妊娠并发症.
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肽核酸夹提高孕妇血浆胎儿父源性β珠蛋白突变基因检出率的研究
目的 探讨利用肽核酸夹提高孕妇血浆胎儿父源性β珠蛋白突变基因的检出率,为地中海贫血(地贫)无创性产前诊断提供依据.方法 选择妊娠7 ～ 20周的孕妇共38例,丈夫基因型为41-42M/N,而孕妇基因型正常或为其他β地贫基因突变.以羊水、脐带血或出生后婴儿外周血标本的检测结果作为金标准对照.用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒提取孕妇血浆总游离DNA,再将总游离DNA经过10 g/L琼脂糖凝胶电泳后回收长度100 ～ 300 bp的DNA,然后应用回收后的DNA并加肽核酸夹进行PCR扩增,后采用反向斑点杂交确定基因型并与金标准检测结果进行比较.同时设置扩增方法不同的A、B对照组,对照组A应用总游离DNA并加肽核酸夹,对照组B应用回收后的DNA不加肽核酸夹进行验证.结果 共对38例孕妇外周血浆DNA标本的PCR产物进行杂交检测并和金标准结果进行比较.21例金标准基因型为41-42M/N的标本中,实验组、对照组A和B分别有19、8、12例检出41-42M,敏感度分别为90.5％、38.1％和57.1％;17例金标准基因型正常(N)的标本中,实验组、对照组A和B分别有1、1、2例出现假阳性,特异度分别为94.1％、94.1％和88.2％;准确度分别为92.1％、63.2％和71.1％.进行McNemar x2检验两两比较,实验组与对照组A和B的敏感度和准确度差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 利用肽核酸夹对孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA检测胎儿父源性β-珠蛋白基因突变的方法,不仅具有较高的敏感度、特异度和准确度,而且方法简便、实用.
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母血清及血浆中胎儿游离DNA的研究进展
发现母血浆及血清中胎儿游离DNA,为无创性产前诊断技术开辟新途径.利用母血中有男胎睾丸确定基因(SRY)特异性序列确定胎儿DNA存在.用PCR技术扩增SRY的单拷贝序列(DYS14),确定性别敏感性60%～100%.利用实时定量PCR技术测定母血清和血浆中胎儿DNA浓度,妊娠7周母血清中可确定胎儿DNA,随妊娠周增加胎儿DNA量也增高.另证明非整倍体核型胎儿在母血浆中的DNA浓度高于正常核型胎儿,母血浆中定量测定胎儿游离DNA技术可能成为筛查染色体非整倍体核型胎儿的一种手段.
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孕妇血浆中游离DNA在无创性产前诊断胎儿ABO血型中的应用
目的 探讨利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型的可行性和准确性.方法 选择2005年6月至2006年7月在山东省立医院检查的孕中晚期单胎O型血孕妇105例,采用QIAampDNA Blood Mini Kit提取孕妇血浆中游离DNA;聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法检测ABO血型基因型.血清学方法检测ABO血型表现型.结果 93例胎儿利用孕妇血浆中游离DNA与利用脐血DNA检测的血型基因型相符,即诊断符合率为88.6%(93/105).12例血型产前诊断不符的胎儿均来自于66例妊娠非O型血胎儿的孕妇,39例O型血孕妇其胎儿的血型基因型均正确检出.5例经产妇本次妊娠胎儿血型与以前不同,但利用孕妇血浆中游离DNA均能准确检测.结论 利用O型血孕妇血浆中游离DNA进行无创性产前诊断胎儿ABO血型是一种可行途径,值得推广应用.
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利用孕妇血浆中胎儿DNA诊断胎儿ABO血型38例分析
目的 探索一种胎儿ABO血型的无创性产前诊断方法,为新生儿溶血病的预防提供可靠的依据.方法 武汉大学中南医院2005-03-07从38例18～38周可疑母儿血型不合的孕妇血浆中提取胎儿DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测胎儿ABO血型,分别扩增ABO糖基转移酶基因中2个特异性片段,然后分别用Alu1和Kpn1酶切消化,利用限制性片段长度多态性分析确定血型.结果 38例样本中,检测出32例胎儿的血型,新生儿出生后证实28例诊断正确:包括26例孕中期检出21例胎儿的血型, 18例正确;12例孕晚期检出11例胎儿的血型,10例准确.结论 利用孕妇血浆中胎儿DNA诊断胎儿ABO血型,是一种简便可行的无创性方法,值得推广应用.
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利用孕妇血浆游离胎儿DNA产前诊断胎儿RhD血型的研究
目的探讨无损伤性产前诊断胎儿RhD血型的方法.方法西安交通大学第二医院1999年2月至2001年12月,以妊娠14～40周的单胎孕妇为对象,其中RhD阴性孕妇8例,RhD阳性孕妇12例,利用PCR技术对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行RhD基因第10外显子的特异性扩增,扩增片段长度为186bp,另外以等位基因RhCE基因为内对照,扩增片段长度为136bp.结果能同时扩增出186bp和136bp两条带,判断所妊娠胎儿血型为RhD阳性;扩增出136bp一条带,判断所妊娠胎儿血型为RhD阴性.8例RhD阴性孕妇中,5例扩增出136bp一条特异性片段,3例同时扩增出136bp和186bp两条特异性片段;12例RhD阳性孕妇血浆标本,均同时扩增出136bp和186bp两条特异性片段,所有RhD-PCR扩增结果均得到脐血血清学检测结果的证实.结论利用孕妇血浆中游离胎儿DNA对胎儿RhD血型进行诊断,是一种简便、快速、特异性较高的产前诊断方法,值得临床推广应用.
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孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测
目的建立从孕妇外周血中分离有核红细胞(NRBC)及DNA的可靠方法,并鉴定其来源.方法对88例孕妇外周血分别通过密度梯度离心法,流式细胞术(FCM)和荧光激活细胞分离技术(FACS)分离NRBCs.应用套式PCR技术对65例孕妇血浆DNA进行正常男性SRY基因检测.结果①NRBCs:27例样品经密度梯度离心,其中14例分选到1～10个NRBCs.FACS技术对61例样品进行转铁蛋白受体阳性细胞(CD71+)分选,所有样品均有CD71+细胞,其浓度为(0.35±0.25)×10-2.②胎儿DNA:46例怀男胎孕妇血浆DNA中SRY基因检测出率为65.22%(30/46),怀女胎的19例样品SRY基因未检出率为94.74%(18/19).结论从孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展.利用母血中胎儿细胞及DNA诊断遗传性疾病可望成为佳非创伤性产前诊断技术.
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利用孕妇血浆中胎儿DNA检测胎儿的ABO血型研究
目的:探讨一种胎儿ABO血型的无创性产前诊断方法.方法:从28例健康孕妇血浆中提取胎儿DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测胎儿ABO血型,通过出生后全血血清学检测证实.结果:28例样本中,产前检查能正确显示胎儿血型的有22例,总准确率为78.6%.结论:利用孕妇血浆中胎儿DNA诊断胎儿ABO血型,是一种简便可行的无创性方法,值得推广应用.
关键词： ABO血型 孕妇血浆 胎儿DNA 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 -
在孕9周前检测孕妇外周血中胎儿的性别
目的 评价使用孕妇外周血中的胎儿细胞和游离DNA进行无创伤性产前诊断的可能性.方法 研究对象为150名孕5～9周的孕妇.使用淋巴细胞分离液和3%的明胶分离胎儿细胞.使用荧光定量PCR(FISH)检测母血中胎儿细胞Y染色体的末端.同时使用巢氏PCR和荧光定量PCR(FQPCR)检测150名孕妇血浆中的胎儿SRY基因.结果 FISH、巢氏PCR以及FQ-PCR 3种方法的敏感性分别为73.2%、78%和85.4%,特异性分别为96.2%、100%和100%.使用FISH,早在孕49d检测到胎儿细胞,使用巢氏PCR和FQ-PCR早在孕49d和42d检测到孕妇血浆中的胎儿游离DNA.结论 3种方法对无创伤性产前诊断都是适合的,其中FQ-PCR因其检测时间较早而成为优选择.
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孕妇血浆中游离胎儿DNA在产前诊断中的初步应用
目的 探讨孕妇血浆中游离胎儿DNA在非创伤性产前诊断中的可行性.方法 用柱分离法提取46例孕妇血浆中胎儿DNA,用巢式聚合酶链反应(PCR)技术扩增其胎儿SRY基因,并引入内参照基因ATL1特异序列.结果 28例孕男胎的孕妇血浆中有26例经巢式PCR扩增出SRY基因,18例孕女胎的孕妇血浆中有17例经巢式PCR只扩增出ATL1基因.灵敏度和特异度分别为92.9％( 26/28)和94.4％( 17/18),总符合率为93.5％(43/46).结论 应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断灵敏度和特异度较高,是一种非创伤性产前诊断方法,具有广泛的临床应用前景.
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母亲血浆中胎儿RhCcEe基因的检测
目的 探讨用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因的可行性.方法 用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA,应用9个(D3S1358、VWA、FGA、D5S818、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11、D18S51)具有高度多态性的短串联重复序列(STR)位点,对孕妇血浆样本中DNA进行STR等位基因扩增.同时检测孕妇丈夫外周血来源DNA,通过胎儿父源性等位基因在孕妇血浆中的检出确认胎儿DNA的存在.通过FQ-PCR法检测34例孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因,并对出生后婴儿脐带血进行RhCcEe血清学表型分析,回顾性评价胎儿基因分型结果 的准确性.结果 在10例母亲表型为ee纯合子的样本、11例母亲表型为CC纯合子的样本、5例母亲表型为EE纯合子的样本及8例母亲表型为cc纯合子的样本中均分别检测到了母亲所缺少的E、c、e、C基因,这与出生后婴儿外周血血清学分型相吻合.结论 FQ-PCR法是一种灵敏度和准确性高,且特异性强的非创伤性产前诊断胎儿RhCcEe基因型的方法 ,当母亲为纯合子时,血将中胎儿RhCcEe基因分型具有临床意义,可用于新生儿溶血病的预防和诊断.
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实时荧光定量PCR检测早产孕妇血浆中游离胎儿DNA
近年来研究学者证实孕妇血浆中存在着胎儿DNA[1],这一发现有极重要的潜在临床应用价值,这为非损伤性的疾病诊断及孕期监测提供了一种新的工具.本研究应用实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测出现早产宫缩的孕妇血浆中游离胎儿DNA来确定胎儿DNA在母血浆中的存在,以期为孕期监测和早产的病理生理过程的进一步研究奠定基础.
关键词： 实时荧光定量聚合酶链反应 胎儿DNA 早产
