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高敏感度酶联免疫吸附测定法检测分泌蛋白MPB64对于活动性肺结核诊断的价值
目的 评价以结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPB64为检测抗原的高敏感度酶联免疫吸附测定法(high sensitivityenzyme-linked immunosorbent assay,HI-ELISA)用于检测痰液中MTB的价值.方法 选取97份储存的疑似肺结核患者的痰标本,分别进行BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960培养”)、MTB/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测系统(Gene Xpert MTB/RIF,简称“Xpert检测”)和HI-ELISA检测,通过与MGIT960培养比较来评价HI-ELISA的诊断效能.结果 本研究97份痰标本中,MGIT 960培养、HI-ELISA检测MTB的阳性率分别为36.08％(35/97)、32.99％(32/97);与MGIT 960培养比较,HI-ELISA的检测敏感度、特异度、总体符合率分别为88.57％(31/35)、98.39％(61/62)、94.85％(92/97).在Xpert检测阳性的66份痰标本中,MGIT960培养、HI-ELISA检测MTB的阳性率分别为51.51％(34/66)、48.48％(32/66);与MGIT 960培养相比,HI-ELISA的检测敏感度、特异度、总体符合率分别为91.18％(31/34)、96.88％(31/32)、93.93％(62/66).Xpert检测MTB为阴性的31份痰标本中,仅有1份标本的MGIT 960培养阳性而HI-ELISA未能检测到MTB,其他30份标本检测结果全部相符,符合率为96.77％(30/31).结论 HI-ELISA可以特异性检测MTB活菌,对活动性肺结核的诊断及治疗评价有很高的应用价值.
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结核分枝杆菌胶体金法对分枝杆菌菌型快速鉴别价值探讨
法快速诊断试剂盒鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌,方法简便、快速,是分枝杆菌菌型鉴别的有效方法.
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肺癌组织中结核分枝杆菌L-型及MPB64基因的检测
目的 调查肺癌组织、结核病肺癌组织中结核分枝杆菌L-型(MTB-L)的感染状况,以分析MTB-L在肺癌形成过程中的作用.方法 选择肺癌组(187例)、结核病组(32例)及非肺癌、非结核病对照组(50例,对照组),对各组的手术切除肺组织标本,采用IK抗酸染色检测MTB-L,Ziehl-Neelsen染色检测MTB-杆菌型,原位杂交检测MP864基因的表达.结果 肺癌组和对照组MTB-L阳性率分别为66.8%(125/187)、5%(2/40),差异有统计学意义(P<0.05).肺癌组和对照组MPB64基因阳性率分别为80.7%(151/187))、8.1%(3/40),差异有统计学意义(P<0.05).肺癌组各组织类型、各组织学分级、各病理分期及淋巴结有、无转移与MTB-L结果 之间,差异均无统计学意义(P>0.05).MPB64基因检测结果 之间,差异均无统计学意义(P均>0.05).肺癌组织中MTB-L与MTB检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 结核分枝杆菌是以L型为主要形式存在于肺癌组织中;MTB-L的MPB64基因在肺癌组织的癌细胞核内高度表达,提示MTB-L可能与肺癌的发生相关.
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MPB64在杆状病毒系统中的表达纯化及免疫原性鉴定
目的：在杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达结核分枝杆菌蛋白MPB64，并鉴定其免疫原性。方法：目的基因MPB64连接到pFastBac载体，获得pFastBac-MPB64质粒转化DH10 Bac感受态，通过Tn7转座片段将目的基因转座到Bacmid中，得到Bacmid-MPB64穿梭载体，脂质体包被后转染Sf 9细胞收获P1代病毒，重复转染Sf 9细胞三次获得高滴度的P4代病毒，收集细胞上清通过Q Sepharose FF和Ni亲和层析柱两步层析纯化得到目的蛋白MPB64。纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠并检测血清中抗体滴度，ELISA检测MPB64蛋白刺激脾脏细胞产生IFN-γ的浓度，MTT法检测目的蛋白对免疫后小鼠脾脏细胞的增殖作用。结果：MPB64在昆虫细胞中成功表达，纯化后蛋白纯度达90％以上，蛋白产量为35 mg／L，纯化蛋白能有效刺激BALB／c小鼠产生抗体，提高小鼠脾脏细胞培养基中IFN-γ的含量，目的蛋白在0.2～100μg／ml之间对脾脏细胞有明显的促增殖作用。结论：成功在杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达了具有免疫原性的MPB64蛋白，为生产结核病疫苗奠定了基础。
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MPB64特异性抗原检测在结核病临床快速诊断中的应用价值
据世界卫生组织估算,全球有近1/3的人群感染了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis ,MTB),每年新增800-1000万患者,大约有300万人死于结核病.其中有部分肺结核病人同时感染非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacterium,NTM).NTM的临床表现、X线检查特征与肺结核极其相似,痰涂片抗酸染色直接镜检二者在形态上很难鉴别,但在临床治疗上差别很大,结核分枝杆菌(MTB)对一线抗结核药物(INH、RFP、EMB、SM)敏感而多数非结核分枝杆菌(NTM)对抗结核药耐药率高或对抗结核药物呈天然耐药[1],若按结核病治疗,即使病人经过长期规则化疗,疗效也依然不好,成为所谓的"难治、复治"结核病人.由此可见,分枝杆菌的培养和菌种鉴定对结核病的诊断、鉴别诊断和有效化疗有着重要的作用.
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米氏7H9液体培养联合MPB64胶体金法快速检测结核分枝杆菌
目的 观察米氏7H9液体培养联合MPB64免疫胶体金法快速检测结核分枝杆菌(MTB)的应用价值.方法 选取247例临床确诊肺结核患者的痰标本进行痰涂片抗酸染色,米氏7H9液体培养基和改良酸性罗氏培养基培养,7H9液体培养联合MPB64免疫胶体金法检测,对结果 进行比较分析.选取其中的12例,单独用米氏7H9液体培养和米氏7H9液体培养联合MPB64免疫胶体金法进行检出时间对比.结果 247例肺结核患者痰涂片阳性率为14.6%,改良罗氏培养基阳性率为20.2%,米氏7H9液体培养基阳性率24.3%,米氏7H9液体培养联合MPB64免疫胶体金法阳性率为24.7%.7H9液体培养结合MPB64免疫胶体金法在培养的第15 d检出11例(19.7%)阳性;而单纯的7H9液体培养加抗酸染色法在第15 d只栓出4例(33.3%)阳性.结论米氏7H9液体培养联合MPB64免疫胶体金法可作为较为敏感和特异的检测MTB感染的方法 ,并可以有效地区分MTB和非MTB.
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MPB64免疫胶体金快速检测法在分枝杆菌菌种鉴定中的应用
目的 研究MPB64免疫胶体金快速检测法在分枝杆菌菌种鉴定中的应用价值.方法 用MPB64免疫胶体金快速检测法对7种分枝杆菌标准菌株和分枝杆菌快速荧光培养法培养阳性标本进行菌种鉴定,并同时与传统的PNB改良罗氏(L-J)法鉴定结果进行比较.结果 结核杆菌标准菌株H37Rv、牛结核杆菌MPB64胶体金法与L-J法均为阳性,其余5种非结核分枝杆菌均为阴性;40株临床分离菌株两法结果符合率为100%.MPB64胶体金法在培养结果报告的当天即可作出鉴定结果,较传统方法提前了28 d.结论 MPB64免疫胶体金法在分枝杆菌菌种鉴定中能快速有效地区分结核杆菌与非结核分枝杆菌.
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结核分枝杆菌液体培养配合MPB64的免疫胶体金法检测在结核诊断中的应用
目前在人类和动物的传染病中,结核病仍是人、畜健康的重要威胁.由于人体感染结核分枝杆菌后,首先是结核分枝杆菌抗原的升高.因此,检测结核特异性抗原具有早期诊断价值[1].结核特异性分泌蛋白是结核杆菌在生长过程中分泌到细胞外的一类蛋白[2].分泌蛋白的分布特异性和良好免疫性决定其可以用于结核病的免疫学抗原抗体诊断.本次研究利用结核分枝杆菌胶体金法对该菌分泌的MPB64特异性蛋白进行检测,探讨现有结核分泌蛋白抗原MPB64检测试剂在肺结核早期诊断中的应用价值.报道如下.
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MPB64抗原检测快速诊断结核分枝杆菌的临床价值
目的 比较痰涂片抗酸染色、改良酸性罗氏培养、MPB64的免疫胶体金法用于检测结核分枝杆菌特异性的分泌蛋白质MPB64,评价MPB64的免疫胶体金法在结核分枝杆菌快速检测中的应用价值.方法 选取438例确诊肺结核患者痰液,进行痰涂片抗酸染色、7H9液体培养基和改良酸性罗氏培养基培养、基于MPB64的免疫胶体金法检测,对结果进行比较分析.并选取痰涂片确认为阳性的标本33例,用米氏7H9液体培养和基于MPB64的免疫胶体金法进行检出时间对比.结果 痰涂片阳性率为14.8%,罗氏培养阳性率为20.7%,7H9液体培养阳性率24.8%,MPB64的免疫胶体金法阳性率为25.1%.基于MPB64的免疫胶体金法在培养的第15天检出32例阳性;而单纯的7H9液体培养加抗酸染色检测法在第15天只检出11例阳性.结论 7H9液体培养配合基于MPB64的免疫胶体金法可以作为一种较为敏感和特异的检测结核分枝杆菌感染的方法,并可以有效的区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌.
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137份痰标本结核MPB64抗原检测结果分析
目的 为研究结核分枝杆菌MPB64抗原检测结果敏感性、特异性以及早检测时限,以寻找新型更好更快结核病病原检验方法,为结核病早诊断、早治疗提供科学依据.方法 痰标本经4%氢氧化钠恰当处理后,用PH6.8磷酸盐缓冲液中和,再接种快速变色培养基培养6-8天,吸取培养匀液滴加结核MPB64抗原胶体金免疫层析板;以痰厚涂片抗酸染色镜检找抗酸杆菌和改良酸性罗氏培养基培养结核杆菌作对照.结果 痰涂片阳性率为11.68%;酸性罗氏培养基培养结核杆菌阳性率为24.82%;结核MPB64抗原检测阳性率为35.77%.酸性罗氏培养基培养结核杆菌检出时限平均35天,而结核MPB64抗原检测平均为7天.结论 结核MPB64抗原检测具有敏感、特异和快速等特点,是对目前结核病病原学检验方法的有力补充,适合基层结防机构开展.
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免疫胶体金法检测支气管肺泡灌洗液MPB64对肺结核的诊断价值
目的 探讨免疫胶体金法检测支气管肺泡灌洗液 (BALF)结核杆菌特异性分泌抗原MPB64在肺结核诊断中的应用价值.方法 对113例肺结核患者和80例非结核患者的BALF进行免疫胶体金法检测MPB64、荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌DNA及改良酸性罗氏培养基法结核分枝杆菌培养,比较分析3种方法的检测结果.结果 MPB64免疫胶体金法与荧光定量PCR法、改良酸性罗氏培养基法的符合率分别为58.03%和57.51%;以临床诊断结果为参照,免疫胶体金法检测MPB64 的敏感度、特异度与准确度分别为61.95%、87.50%、72.54%.以荧光定量PCR法为参照,免疫胶体金法检测MPB64的敏感度、特异度与准确度分别为49.30%、63.11%、58.03%;以改良酸性罗氏培养基法为参照,免疫胶体金法检测MPB64的敏感度、特异度与准确度分别为48.21%、61.31%、57.51%.结论 免疫胶体金法检测MPB64应用于支气管肺泡灌洗液对肺结核的临床诊断有辅助诊断价值,但检测的假阳性、假阴性值得进一步分析研究.
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痰液中MPB64蛋白检测在肺结核诊断中的临床应用及其常见菌对检测影响的研究
目的 探讨痰液MPB64蛋白检测在临床诊断肺结核的价值及常见菌对MPB64检测的影响.方法 以11例涂片抗酸染色阳性且胸片出现肺部阴影的患者的痰标本为实验组,以11例涂片抗酸染色阴性且胸片无肺部阴影的患者的痰标本为对照组,分别进行免疫胶体金法检测MPB64蛋白、荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测结核杆菌DNA和涂片抗酸染色,对3种检测方法的检测结果进行比较、分析；对临床送检痰标本中分离的65株常见菌,用蛋白胨水增菌24 h,采用免疫胶体金法检测MPB64.结果 实验组中,免疫胶体金法检测MPB64蛋白、荧光定量PCR检测结核杆菌DNA的敏感度分别为72.72％、45.45％,免疫胶体金法显著高于荧光定量PCR法,但其特异度(45.45％)和准确度(59.09％)则低于荧光定量PCR(100.00％、72.73％);MPB64蛋白检测与涂片染色、荧光定量PCR检测结果的符合率分别为50.00％、59.09％; 25株金黄色葡萄球菌增菌液中MPB64检测试验阳性,阳性率100％,其余菌株增菌液阴性.结论 痰液中MPB64蛋白检测快速、简便、敏感性高,但特异性低；金黄色葡萄球菌菌株的存在可能造成对痰液MPB64检测的假阳性.
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应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的初步研究
目的 探讨应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌的临床应用价值.方法 应用抗酸染色涂片阳性样本进行分枝杆菌培养前处理,接种于BacT/A1ert 3D全自动分枝杆菌培养系统培养基中.在培养监测的同时,每天定时测定培养液中的结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64,比较它们可指示有结核分枝杆菌生长在时间上的差异.结果 在12例涂片阳性样本中,仪器系统对12例样本都指示培养阳性结果,其中10例样本MPB64检测阳性;对12例样本进行分枝杆菌菌鉴定,培养指示阳性、MPB64指示阴性的2例样本为非结核分枝杆菌,培养与MPB64均指示阳性的10例样本为结核分枝杆菌;仪器系统指示培养阳性的平均时间为11.5天,MPB64检测指示有结核分枝杆菌生长的平均时间为6.5天.结论 应用MPB64单克隆抗体检测液体培养基中结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64来指示有无结核分枝杆菌生长具有操作简便、报告结果快速的特点,值得更进一步研究.
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结核分枝杆菌MPB64抗原的制备与纯化
根据GenBank结核分枝杆菌基因序列设计引物扩增出 MPB64基因，连接至原核表达载体 pET32a(+)，转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，经过 IPTG诱导后，进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明，克隆的MPB64基因同源率为98.36%，重组蛋白以可溶形式在细胞周质中表达，大小为24KDa。采用切胶回收水平电泳洗脱纯化出的MPB64具有反应原性。为进一步研究结核快速诊断试剂奠定了基础。
