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蛋白激酶Cθ信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人γδT细胞增殖和分化中的作用
目的 研究蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)信号途径在结核分枝杆菌抗原(Mycobacterium tuberculosis antigen,Mtb-Ag)激活人γδT细胞增殖和分化中的作用.方法 健康人外周血单个核细胞(PBMC)用Mtb-Ag和IL-2优势刺激和扩增γδT细胞,或预先用5.0μmol/L Rottlerin(楸毒素)预处理,培养不同时间后,用流式细胞术(FCM)检测γδT细胞表面活化分子和细胞因子表达;同时采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记细胞,流式细胞术分析Mtb-Ag刺激γδT细胞后的增殖和各子代细胞百分率.结果 PBMC经Mtb-Ag刺激后3d,γδT细胞CD69和CD25表达分别为46.2%和45.6%,而Rotderin预处理显著地抑制了CD69和CD25表达(P＜0.01);PBMC经Mtb-Ag激活培养5、10和15d,培养扩增细胞中的γδT细胞比例分别为9.6%、54.6%和82.4%,其中第5天已有少部分γδT细胞发生增殖,第10天和第15天时几乎全部γδT细胞分裂都在6代以上,用Rottlerin预处理,显著抑制了γδT细胞增殖反应,但在培养第10天后仍有少部分γδT细胞发生增殖反应;同时在培养第7天、14天和21天,用PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)再刺激后,产生IFN-γ的γδT细胞均在80%左右;培养21d时,有2.6%的γδT细胞表达IL-4.在Rottlerin预处理组产生TH1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞均显著减少(P＜0.05),而γδT细胞表达TH2型细胞因子IL-4则几乎完全抑制(P＜0.01).结论 PKCθ信号途径在Mtb-Ag刺激γδT细胞的增殖和分化中均起重要作用.
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结核分枝杆菌抗原及其在结核病诊断中的研究进展
本文选取2011年5月-2012年5月由某地肺科医院、结核病防治机构等提供的临床上确认为结核病和非结核病患者，以及从社会上招募而来的健康志愿者，共计720例作为研究对象。采用结核分枝杆菌特异性蛋白来对结核病诊断进行研究。研究结果显示，菌阴性肺结核敏感度为66.3%，菌阳性肺结核敏感度为69.9%，肺外结核病敏感度为75.4%，结核总敏感度为70.6%。对于特异度，健康人群为68.4%，结核病以外的其他肺部疾病患者为79.1%，结核总敏感度为71.6%。因此本文得出，在临床结核病诊断中，采用结核分枝杆菌特异性蛋白诊断结核病具有良好应用价值，值得在今后大力推广。
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结核分枝杆菌抗原及其在结核病诊断中的研究进展
结核病仍是当今影响人类健康、流行性广、病死率高的感染性疾病之一.由于细菌学检查应用有限、卡介苗(BCG)接种在我国的广泛使用,分子生物学诊断技术不但存在假阳性干扰,与细菌学检查一样也受检验标本的约束等问题,使得基于特异性抗原的结核病血清学实验室诊断成为今后的主要研究方向.本文就近年发现一些新的结核分枝杆菌菌属抗原和特异性抗原,特别是BCG删除区内抗原的生物学特性及其在结核病诊断中的研究进展进行综述.
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结核分枝杆菌液体培养配合MPB64的免疫胶体金法检测在结核诊断中的应用
目前在人类和动物的传染病中,结核病仍是人、畜健康的重要威胁.由于人体感染结核分枝杆菌后,首先是结核分枝杆菌抗原的升高.因此,检测结核特异性抗原具有早期诊断价值[1].结核特异性分泌蛋白是结核杆菌在生长过程中分泌到细胞外的一类蛋白[2].分泌蛋白的分布特异性和良好免疫性决定其可以用于结核病的免疫学抗原抗体诊断.本次研究利用结核分枝杆菌胶体金法对该菌分泌的MPB64特异性蛋白进行检测,探讨现有结核分泌蛋白抗原MPB64检测试剂在肺结核早期诊断中的应用价值.报道如下.
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新疆地区结核分枝杆菌北京/W系和非北京/W系间五种重要蛋白表达差异的初步研究
目的 检测北京/W系和非北京/W系结核分枝杆菌HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64在基因、mRNA和蛋白水平有无差异,探讨5个重要蛋白对于北京/W系菌株广泛流行的可能作用.方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,其中北京/W系与非北京/W系菌株各30株,运用DNA直接测序法检测北京/W系和非北京/W系菌株HspX、Hsp65、38 kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物,采用实时定量PCR技术检测细菌在对数生长期5个重要蛋白的编码基因mRNA的表达水平,使用Western blot技术检测细菌感染巨噬细胞24 h后5个蛋白在不同菌株中的表达水平.结果统计分析采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义.结果 HspX、Hsp65、38kDa、Ag85B和MPT64对应编码基因的PCR扩增产物测序均未发现突变.HspX、Hsp65在北京/W系菌株中的mRNA在对数生长期的表达差异均无统计学意义(P>0.05),而在感染巨噬细胞24 h后,细菌中两个热休克蛋白的表达高于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05).在细菌感染细胞前后,北京/W系菌株中38 kDa、Ag85B的mRNA和蛋白水平的表达均低于非北京/W系菌株,差异有统计学意义(P<0.05).MPT64在mRNA和蛋白水平的表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论 与非北京/W系菌株比较,北京/W系菌株中HspX、Hsp65高表达,38 kDa、Ag85B表达较低,推测这几个蛋白表达的改变可能与北京/W系菌株的流行有一定的关系.
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结核分枝杆菌抗原诊断研究进展
回顾性调查结果表明,我国结核病的误诊率可达24%,提高结核病的实验诊断率已刻不容缓.结核病的免疫学检测方法在诊断结核病中起到了重要的作用,其早期采用的抗原为菌体抗原、结核菌素、细胞壁及细胞膜成分的复合抗原等,1998年Cole等在《Nature》杂志上报道了结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株的全基因组序列,加速了对重组抗原的克隆、表达,近年来对重组抗原有了较多的研究,特据抗原在菌体中的定位,将之分为分泌抗原、胞壁脂膜抗原和胞浆应激蛋白抗原三类讨论之.
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新型结核杆菌抗原的免疫原性和保护效力
鉴于结核病仍然是全球人类发病和死亡的主要原因，故迫切需求一种新的疫苗。结核亚单位疫苗已经显示出在人类能诱导强有力的免疫应答，并在HIV地方流行区可作为一种BCG的替代疫苗加以使用。在这项研究中，作者研究了16种不同的新的结核分枝杆菌抗原的保护效力，作者采用肺部结核病小鼠模型进行此项研究。这些抗原被用来作为亚单位疫苗而与双十八烷基溴化铵（ DDA ）-D （＋）同海藻糖6．6 dibenenate（TDB）（DDA／TDB）佐剂配制成制剂，作为单价疫苗接种小鼠或者多价联合疫苗接种小鼠，这些抗原中有6种（ Rv1626、Rv1753、Rv1789、Rv2032、Rv2220及Rv3478）抗原同未接种的对照小鼠比较，能够降低小鼠肺部的细菌负荷。这6种抗原中有3种（ Rv1789、Rv2220和Rv3478）能够诱导具有保护水平的免疫，而这种免疫与具有高度免疫原性的抗原85 B所诱导的保护相当（相对于幼鼠在肺部产生＞0．5 log10 CFU降低）。重要的是当这3种抗原联合应用时，所产生的保护作用基本上与 BCG 所介导的保护作用相当。当或者是Rv1626或者是Rv2032与具有高度保护性的E6-85融合蛋白（抗原85 B 与ESAT-6相融合）联合应用时，观察到的保护作用与BCG疫苗诱导的在气溶胶感染后1个月和3个月的保护水平相当，并且明显地比单独给予E6-85疫苗接种于感染后3个月时的保护水平要高一些，使用多参数流式细胞仪检测，单功能性IFN-γCD4 T细胞和不同的多功能性CD4 T细胞亚类能够分泌多种细胞因子（ IFN-γ、TNF-α和／或IL-2），显示这是由3种重要的保护性抗原诱导的，并伴有脾细胞CD4 T细胞的频率要比仔鼠对照组中观察到的结果明显的高。这些具高度免疫原性的TB抗原的鉴定以及抗原联合应用将会使人们改进抗结核策略成为可能。
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保护 HLA-DR3转基因鼠抗结核杆菌感染的复合期多表位疫苗
结核分枝杆菌（ Mtb ）每年导致近200万人死亡。 BCG是当前唯一使用的结核病疫苗，能够诱导不恒定的保护力，不能防止潜伏性结核病的复活。因此，急切需要有效的疫苗来补充BCG。由于在细菌的繁殖阶段与休眠阶段结核分枝杆菌的蛋白质组在性质和数量上不同，所以改良的结核病疫苗应该能够诱导产生对感染各个阶段表达的结核分枝杆菌抗原的免疫应答。因此，这种“复合期”疫苗应该由结核分枝杆菌感染不同阶段表达的（免疫决定簇）抗原组成。作为一个概念性多级疫苗，我们通过融合五种HLA-DR3限制性T细胞表位构建了一个多表位肽（ polyepitope ），这些限制性表位来源于不同的结核分枝杆菌蛋白，有繁殖期高表达产物（Ag85B，hsp65，19kDa脂蛋白），有休眠菌富表达而且经结核菌素皮下测试阳性（ TST＋）个体验证的产物（ hsp16， Rv1733 c ）。在体外试验中，结核病治愈后HLA-DR3＋而非HLA-DR3-病人和结核菌素皮下测试阳性个体的外周血单核细胞对复合期多表位肽反应良好。使用缺乏内源性鼠Ⅱ类基因的 HLA-DR3转基因小鼠模型，在体内分析了复合期多表位肽的免疫原性和保护效力。用CpG做佐剂的复合期多表位肽免疫动物产生了高水平的IgG以及多功能CD4＋T细胞，它们能够产生HLA-DR3限制性表位特异性的IFN-γ、TNF和IL-2。重要的是，当作为预防性疫苗时用结核菌攻击之后，复合期多表位肽的免疫降低了肺部结核杆菌的数量。考虑到可用于免疫识别的潜在Mtb抗原的广谱性，我们的模型数据证明了复合期多表位肽疫苗预防结核病的潜力。
