细胞与分子免疫学杂志
Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology 세포여분자면역학잡지
- 主管单位： 中国免疫学会；第四军医大学
- 主办单位： 陕西省免疫学会,中国免疫学会
- 影响因子： 0.81
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1007-8738
- 国内刊号： 61-1304/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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CD40 发夹siRNA真核表达载体构建及其对CA46细胞CD40表达的影响
目的: 构建人类CD40膜蛋白siRNA的真核表达载体, 观察其对CA46细胞上CD40表达、细胞增殖能力和凋亡的影响.方法: 合成两条编码发夹siRNA序列的单链DNA, 并将其克隆到pSilenCircle载体中, 构建含目的基因片段的重组质粒siCD40/pSilenCircle.以同样的方法, 分别构建相对应的编码反义RNA及无关基因的重组质粒antiCD40/pSilenCircle和siFly/pSilenCircle.以上述重组质粒分别瞬时转染CA46细胞后, 用流式细胞仪检测CA46细胞上CD40的表达和细胞凋亡情况, 用MTS法(改良的MTT法)测定细胞的增殖能力.结果: ①成功地构建了两个CD40发夹siRNA的真核表达载体siCD40/pSilenCircle、 两个相对应的反义RNA真核表达载体antiCD40/pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly/pSilenCircle.②与siFly/pSilenCircle转染组相比较, siCD40/pSilenCircle转染组和antiCD40/pSilenCircle转染组CA46细胞上CD40的表达均明显减少, 但细胞的增殖能力和凋亡未发现明显变化.结论: 构建的两个CD40发夹siRNA的真核表达载体siCD40/pSilenCircle, 可有效地抑制CA46细胞上CD40分子的表达, 但不影响细胞的增殖和凋亡.RNA干扰技术可望作为一种有效地调控基因功能的方法.
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预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠
目的: 提高可溶性HLA-A2-肽复合物体外折叠效率.方法: 在变性非还原条件下提取原核表达的HLA重链(HC).通过离子交换及硫酸铵沉淀初步纯化后, 在β2微球蛋白(β2m)及特异性抗原肽(Try369-377)存在的情况下, 于pH 6.6 的折叠缓冲体系中稀释复性.利用Western blot及ELISA检测折叠产物.结果: 折叠复合物中主要含有HLA-A2-抗原肽复合物和β2m, 较少含有HC聚合体; 折叠效率较传统方法提高2.5倍.结论: 通过与传统方法作比较, 证实此法折叠效率比传统方法高, 为进一步HLA-肽四聚体及人工抗原提呈细胞的制备可提供足够可溶性的HLA-A2-肽单体.
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MBL对树突状细胞体外分化成熟的影响
目的: 探讨甘露聚糖结合凝集素(MBL)对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)分化成熟的影响.方法: 以天然人MBL刺激MoDC, 在倒置显微镜下观察DC的形态; 用FACS分析DC的表型; 用 3H-TdR掺入法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力; 以酵母多糖颗粒吞噬试验评估DC的抗原摄取能力; 用ELISA检测DC培养上清中IL-12 和TNF-α的含量.结果: MBL刺激的DC表面分子CD1a、 CD83、 CD40、 CD80、 CD86和MHC-DR的表达均上调, 摄取酵母多糖颗粒的能力降低, 激发初始T细胞增殖的能力加强, 分泌的IL-12增多但几乎不分泌TNF-α.结论: MBL能诱导DC分化成熟, 提示其可能通过调节DC的功能而参与获得性免疫应答.
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人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达
目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能.方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3.1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同转化大肠杆菌.以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒.采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Western blot检测TSLP蛋白的表达.结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因, 病毒的滴度可达1×1011pfu/L.Western blot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达.结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒.所制备的Ad-TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础.
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人CD59基因的突变和表达及其活性研究
目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用.方法: 分别构建两种含有hmCD59 全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编号为hmCD59-1-CHO及hmCD59-2-CHO).应用荧光抗体技术、免疫酶联技术及Western blot, 进一步检测hmCD59蛋白在转染细胞膜表面的表达.通过双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF/AM)荧光染料释放试验, 对hmCD59蛋白糖基化前后的抗补体活性进行检测.结果: 筛选出的阳性克隆细胞用荧光抗体技术、免疫酶联技术检测表明, 在细胞膜表面有hmCD59分子表达.将细胞的裂解物进行Western blot证实, 在其相对分子质量(Mr)为20 000处可见1条与CD59的Mr相当的蛋白带.BCECF/AM荧光染料释放试验提示, 两种突变质粒的表达产物均具有抗补体活性, 糖基化后活性减弱.结论: 获得两株可稳定表达hmCD59的细胞.表达的hmCD59具有抗补体活性, 但糖基化后活性减弱.
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猪FasL基因在猪软骨细胞上的表达和鉴定
目的: 实现猪Fas配体(FasL)基因在猪软骨细胞中表达和鉴定.方法: 用RT-PCR扩增猪FasL基因片段, 构建重组pGCEN-FasL逆转录病毒载体, 并转染PA317细胞.经G418筛选获得高滴度的病毒液, 感染猪软骨细胞, 应用FACS和Western blot检测软骨细胞上FasL的表达.结果: 经酶切分析、测序证明, 成功地构建pGCEN-FasL逆转录病毒载体.转染的软骨细胞表面FasL的表达率为57%.Western blot显示, 在Mr为37 000处有1条特异性蛋白带, 具有诱导Fas +细胞凋亡的作用.结论: 成功地构建重组猪FasL基因的逆转录病毒载体, 并在转染的软骨细胞上高表达具有生物学活性的FasL, 为建立同种异体软骨细胞移植的免疫耐受提供了实验依据.
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重组腺病毒ΔN IκBα的构建及其对A549细胞中NF-κB活性的抑制
目的: 探讨ΔN IκBα基因对NF-κB活性的调节作用.方法: 构建去除Ser32和Ser36磷酸化位点的IκBα重组腺病毒Ad-ΔN IκBα.A549细胞分为3组: 即LPS组、 Ad-LacZ+LPS组和Ad-ΔN IκBα+LPS组.LPS组单纯用内毒素(LPS)激活NF-κB; Ad-LacZ+LPS 组及Ad-ΔN IκBα+LPS 组在用LPS前2 d, 分别感染Ad-LacZ和Ad-ΔN IκBα.用Western blot、电泳迁移率变动分析(EMSA)和ELISA法分别检测LPS刺激后5 h, 细胞总蛋白中NF-κB的活性和培养上清中TNF-α及IL-6的含量.结果: Ad-ΔN IκBα+LPS组NF-κB的活性, TNF-α和IL-6的含量, 均显著低于LPS组及Ad-LacZ+LPS组.结论: 突变后的IκBα可明显抑制NF-κB活化, 减少TNF-α和IL-6的释放, 有望成为一种强有力的抗炎治疗制剂.
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血管形成抑制因子tumstatin45-132的基因克隆、表达和生物学活性
目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tumstatin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达. 方法: 采用RT-PCR从人胚肾细胞系293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132(45-132位氨基酸)编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coli BL21, 于42℃进行热诱导表达. 用SDS-PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性. 结果: RT-PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coli BL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为9 600的重组蛋白.表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖.结论: 成功克隆全长tumstatin cDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性.
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重组蓖麻毒素A链的融合表达、纯化及活性研究
目的: 制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链蛋白(RTA). 方法: 在RTA序列的C末端引入KDEL信号肽, 克隆到含有硫氧还蛋白(Trx)的融合表达载体pET32a中, 转入大肠杆菌BL21, 在低温(20℃)下用低浓度(0.4 mmol/L)IPTG诱导重组质粒进行表达.表达上清用钴离子亲和层析柱进行纯化, 20～100 mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白.纯化蛋白经SDS-PAGE电泳与Western blot鉴定后, 对pUC19质粒进行超螺旋dsDNA裂解研究. 结果: 每升细菌培养物回收约60 mg 的纯化蛋白, 纯度大于90%, Mr约45 000, 且3 μg纯化蛋白即可以对1 μg超螺旋dsDNA产生明显的裂解活性. 结论: 利用pET32a表达系统可以快速获得大量有高生物活性的可溶性RTA-Trx融合蛋白.
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维生素D3诱导的U937细胞中CD14表达的实验研究
目的: 探讨维生素D3诱导U937细胞上CD14蛋白的表达及其对内毒素(LPS)刺激的反应性.方法: 用0.1 μmol/L Vit D3与U937细胞共同培养24 h诱导CD14基因的表达, 并观察U937细胞对不同浓度的LPS刺激不同时间的反应性.结果: Vit D3能稳定诱导U937细胞表达CD14 mRNA和CD14蛋白.经Vit D3诱导的U937细胞对LPS刺激的敏感性显著增强, 表现为低浓度LPS刺激即能诱导该细胞核中NF-κB激活, 促进TNF-α mRNA的转录和表达, 并将表达的TNF-α释放入培养上清中.结论: Vit D3能诱导U937细胞中CD14基因和蛋白的表达, 并增加其对LPS刺激的反应性.
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HIV-1 Gag、Tat、Rev和Nef蛋白特异性的免疫应答
目的: 探讨中国HIV/AIDS患者HIV-1 Gag、 Tat、 Rev和Nef蛋白特异性CTL应答的特征.方法: 应用覆盖HIV-1B、 C亚型Gag、 Tat、 Rev和Nef蛋白的220个肽段作为抗原, 通过ELISPOT方法检测HIV/AIDS患者HIV特异性CTL应答.结果: 无论HIV-1B亚型还是HIV-1C亚型所构建肽库的应答强度和频率, 主要集中在Gag和Nef蛋白, Tat和Rev蛋白也有不同程度的应答.HIV-1 B、 C亚型间应答比较, 整体应答强度大致相同, 但免疫优势区间存在着一定的差异, B亚型Gagp24亚蛋白的288～313氨基酸区应答强, 而C亚型Gagp24亚蛋白的155～181氨基酸区应答强; 两个亚型免疫优势区应答频率高的都是Nef蛋白106～143氨基酸区(48.1%). 结论: 中国人群CTL应答多集中在Gag和Nef蛋白, B、 C亚型间略有差异且存在交叉识别, 这对设计针对中国人群的HIV疫苗是有重要的意义.
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凋亡抑制蛋白survivin在活化T细胞中的表达及其意义
目的: 探讨survivin在活化T细胞的表达及其意义.方法: 经丝裂原与同种抗原刺激激活T细胞, 免疫细胞化学染色后观察survivin和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.用流式细胞术检测CD3、 CD25、 Survivin的表达及细胞凋亡.给BALB/c裸鼠输注C57BL/6小鼠脾细胞后第4～7天, 观察肝脏内T细胞浸润和survivin的表达.结果: ConA刺激后培养的脾细胞可表达survivin(表达不局限于G2/M期).survivin+细胞为T细胞, T淋巴母细胞可同时表达CD25和survivin.survivin+细胞中仅部分细胞表达CD25.ConA刺激淋巴细胞后第6天, 凋亡细胞的百分率明显增加(22.90% vs 5.23% P<0.001).于BALB/c裸鼠输注C57BL/6小鼠的脾细胞后, 于第4～7天,在BALB/c裸鼠肝脏中可观察到T细胞浸润并表达Survivin.结论: T细胞激活后可表达survivin, 故可作为活化T细胞的标志.T细胞持续表达survivin, 需要在体内与抗原持续接触.
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重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染对小鼠骨髓DC上表面分子的表达及功能的影响
目的: 探讨重组质粒pcDNA3.1-IL-15对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表面共刺激分子的表达及免疫功能的影响. 方法: 构建真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15, 以其转染小鼠骨髓DC.用流式细胞仪检测转染的DC表面CD40、 CD80及CD86的表达, 并分析转染的DC刺激脾淋巴细胞中CD4+、 CD8+ T细胞亚群的变化.用MTT比色法检测转染的DC刺激T细胞增殖的作用.用ELISA法检测T细胞产生IFN-γ的水平.结果: pcDNA3.1-IL-15转染的DC表面CD40、 CD80及CD86的表达均有不同程度的升高.重组质粒转染的DC可诱导小鼠脾淋巴细胞中CD4+、 CD8+ T细胞增殖, 但CD4+/CD8+ T细胞的比值降低.结论: 重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染可提高DC表面共刺激分子的表达并增强其免疫功能.
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CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定
目的: 鉴定CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位.方法: 以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC), 通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定.用表位预测法选取并合成两种肽分子, 分别脉冲成熟的DC, 并刺激HLA-A2+健康人自体CD8+ T细胞.1 wk后, 用脉冲肽的自体PBMC以每7 d的间隔刺激该CD8+ T细胞3次.以共接受4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL, 用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验, 检测CTL对靶细胞的杀伤效应.用酶联免疫斑点法(ELISPOT), 检测CTL中抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞数.结果: 形态学和流式细胞术的结果显示, PBMC可诱生成熟的DC.肽L235(FLPDHINIV)诱导的CTL, 可特异性杀伤L235脉冲的T2细胞和OVA66+、 HLA-A2+的SW480细胞, 且L235诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞数增加.结论: 卵巢癌相关抗原OVA66的HLA-A2限制性CTL表位L235, 能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答, 为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础.
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CD3AK细胞过继免疫治疗的实验研究
目的: 分析抗CD3分子的单克隆抗体(mAb)yCD3的免疫学特性和生物学活性, 观察其激活的免疫活性细胞CD3AK体外及动物体内的抑瘤作用.方法: 用流式细胞术(FCM)测定yCD3的特异性, 以及CD3AK细胞的免疫表型和产生细胞因子的情况.用 3H-TdR法测定yCD3对淋巴细胞转化的作用; 乳酸脱氢酶法(LDH)测定CD3AK细胞的体外细胞毒活性.建立荷瘤小鼠模型, 观察静脉注射CD3AK细胞后肿瘤生长的情况、 转移灶数量和小鼠存活天数.结果: yCD3与T细胞呈特异性反应, 5 μg yCD3可竞争抑制70%的标准抗CD3抗体与细胞表面CD3分子的结合.yCD3刺激外周血淋巴细胞增殖的有效浓度为8 μg/L, 并与IL-2、 抗CD28抗体有协同作用.活化的CD3AK细胞中CD3+、 CD8+和CD25+细胞增多; 产生IL-2和IFN-γ的CD3+细胞均有不同程度的增加, 在抗CD28抗体协同刺激下分别增加3.29和2.47倍.当效靶细胞比为80∶ 1时, CD3AK细胞对体外肿瘤细胞杀伤的百分率为57.54%.分组观察荷瘤动物, CD3AK细胞治疗组的抑瘤率为33.17%, 对小鼠肿瘤肺转移的抑制率为39.70%, 与LAK细胞联合治疗的疗效更显著.结论: yCD3可活化T细胞, 诱导的CD3AK细胞在体外及动物体内显示抑制肿瘤的作用, 在临床抗肿瘤过继性免疫治疗中具有重要意义.
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姜黄素对K562/A02细胞上P-gp的表达及其功能的影响
目的: 观察姜黄素(curcumin, Cur)对人红白血病多药耐药(mμLtidrug resistance, MDR)细胞系K562/A02细胞上P-gp蛋白表达及功能的影响.方法: 用MTT比色法测定Cur作用后K562/A02细胞对多种化疗药物敏感性的变化; 用流式细胞仪测定Cur对K562/A02细胞内柔红霉素(DNR)潴留的影响; 用RT-PCR法检测Cur作用后K562/A02细胞中mdr-1 mRNA的表达.结果: Cur能增强多种化疗药物对K562/A02细胞的毒性作用.明显提高K562/A02细胞内DNR的浓度(P<0.01).不同浓度的Cur作用后, K562/A02细胞中mdr-1 mRNA的表达逐渐降低, 其中2.5 mg/L Cur处理组与未处理组相比较差异显著(P<0.01).结论: Cur能部分逆转K562/A02细胞的耐药性, 且呈浓度依赖性.Cur的作用机制主要与下调mdr-1 mRNA的表达, 导致细胞膜P-gp的表达减少有关.
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tPA基因局部定位转染抑制兔动脉损伤后内膜增生的研究
目的: 观察局部转染组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因, 对手术损伤兔右髂外动脉后内膜增生的影响并探讨可能的机制.方法: 采用显微外科手术方法, 建立兔右髂外动脉损伤模型.将105只新西兰大白兔随机分为3组, 每组35只.A组为生理盐水对照组, B组为脂质体介导的pBudCE4.1转染组, C组为脂质体介导的pBudCE4.1/tPA转染组.用微注射器将各种转染液注入损伤的血管壁, 每组按实验终点(术后2、 3、 7、 14、 28 d)再分为5个亚组, 每个亚组7只兔.于术后各实验终点, 取损伤段的血管用于病理学检查、电镜观察、 RT-PCR和免疫组化染色检查.结果: 与A组和B组相比较, 术后各时间点C组血管内膜的厚度、内膜的面积和血管腔的狭窄率均显著减小(P<0.01).术后28 d时, C组血管腔的狭窄率比A组和B组分别降低了51.5%和54.2%. 术后各时间点, C组血管壁的tPA mRNA的表达量明显高于A组和B组(P<0.01), 在术后7 d到达高峰, 并持续到28 d.扫描电镜观察显示, C组的血管壁只见少量血小板附着, 未见血栓形成; 而A组和B组的血管壁可见大量血小板黏附聚集, 且有血栓形成.免疫组化染色显示, C组的血管壁血小板源性生长因子(PDGF)阳性细胞的百分率明显低于A组和B组(P<0.01).A组和B组之间相比较, 以上数据差异无显著性(P>0.05).结论: 局部转染tPA基因可抑制血管新生内膜增生及血管再狭窄, 为血管内膜增生的基因治疗提供了一定的实验依据.
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乙型肝炎病毒转基因小鼠C57-TgN(adr2.0)SMMU品系的免疫病理研究
目的: 研究乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠C57-TgN(adr2.0型)SMMU品系的免疫病理学特征, 并与临床人慢性乙肝相比较.方法: 以20只SPF级肝脏有明显病变的HBV转基因小鼠为研究对象, 用间接免疫荧光法通过流式细胞仪, 分别检测转基因小鼠及正常C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、 CD4和CD8表达的水平, 同时取其肝组织和5例本院病理科存档确诊为慢性中度乙型肝炎患者的肝组织石蜡标本, 用EnVision免疫组化染色法检查肝组织内T细胞亚群的分布.结果: 转基因小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、 CD4和CD8表达的水平低于正常对照组小鼠; 肝组织内浸润的单个核细胞多数为CD3+ CD4+细胞, 未发现CD57+、 CD8+细胞.慢性乙型肝炎患者的肝组织内浸润的单个核细胞主要为CD3+ CD4+或CD3+ CD8+细胞和少量CD57+细胞.结论: C57-TgN(adr2.0型)SMMU的HBV转基因小鼠外周血及肝组织中CD的表达与人慢性乙肝患者的外周血及肝组织有明显不同.
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重组TRAIL基因真核表达载体的构建及其诱导喉癌细胞株Hep2凋亡的效应
目的: 研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用. 方法: 利用已有编码凋亡诱导功能区的TRAIL Cdna片断的表达载体Prnde2-1和IL-2信号肽基因序列, 扩增IL-2信号肽基因和TRAIL基因的融合基因, 并克隆入真核表达载体Pgl3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游, 构建TRAIL基因的重组真核表达载体Pgl3-181hTERT /TRAIL.将该重组载体经阳离子脂质体转染入人喉癌细胞株Hep2中, 以台盼蓝拒染法和基因组DNA琼脂糖凝胶电泳, 观察转染的Hep2细胞的凋亡.结果: 构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体Pgl3-181hTERT/TRAIL, 其表达产物能诱导喉癌细胞Hep2凋亡.结论: 成功地构建了重组真核表达载体Pgl3-181hTERT/TRAIL, 为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性.
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膀胱肿瘤细胞培养上清对树突状细胞的形成及功能的影响
目的: 探讨人膀胱肿瘤细胞BIU-87培养上清对树突状细胞(DC)的生成和功能的影响.方法: 分离培养外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC, 实验组加入BIU-87细胞的培养上清液, 以正常培养的DC作为对照组, 应用流式细胞术检测在实验组和对照组不同条件下培养的DC上表面标志的表达, 并用改良的MTT比色法检测和对比两组所培养的DC激活同种异体T细胞的能力及其差别.结果: DC与BIU-87细胞的上清液共培养后, CD1a、 CD83及CD86均呈低表达.实验组与对照组相比较, DC的成熟受到抑制, 对同种异体T细胞激活的作用明显降低(P＜0.05).结论: BIU-87细胞的上清液可抑制DC 的生成及相关表面标志的表达, 这可能是导致膀胱肿瘤患者DC 数量减少和功能降低的原因.
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两种白血病细胞抗原负载DC的体外诱导特异性CTL应答的比较
目的: 比较树突状细胞(DC)与白血病细胞融合及白血病细胞冻融抗原负载DC两种白血病DC疫苗诱导抗原特异性CTL应答的能力.方法: 采用羟乙基淀粉-Ficoll两步法分离外周血单个核细胞(PBMC), 通过贴壁2 h获得黏附的单核细胞, 用GM-CSF加IL- 4诱导培养5 d收获细胞.将细胞分为4组: A组将K562细胞或原代慢性粒细胞白血病(CML)细胞在500 g/L PEG-100 mL/L DMSO诱导下与DC融合; B组加入相应细胞数量的白血病细胞冻融抗原; C组将K562细胞或CML细胞与DC共培养; D组: 单独DC培养组.融合前以红色荧光染料PKH26标记K562细胞, 采用流式细胞仪(FCM)检测PKH26/FITC-抗HLA-ABC抗体双标细胞并评估融合率.培养的第6天, 加入TNF-α诱导DC成熟, 然后分别与自体T细胞共培养, 用MTT比色法检测各组CTL对靶细胞的杀伤活性.结果: GM-CSF加IL- 4和TNF-α依次诱导成熟的DC具有经典的DC的形态和表型特征, 在PEG-DMSO的介导下, DC与白血病细胞的融合率为(17.33～29.94)%.两种抗原负载方案激活的CTL均对表达K562抗原的细胞具有特异性的细胞毒作用.在效靶比相同时, 融合组诱导CTL的杀伤活性强于冻融抗原致敏DC组.结论: 与冻融抗原致敏的DC相比, DC与白血病细胞融合细胞递呈抗原的效率更高, 体外诱导的CTL特异性杀伤靶细胞的作用更强, 有可能用于白血病的免疫治疗.
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逆转录病毒介导的小鼠IL-23基因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤活性
目的: 获得表达小鼠IL-23(mIL-23)基因的小鼠结肠癌细胞株.方法: 应用逆转录病毒载体, 将mIL-23基因导入小鼠结肠癌细胞株Colon26, 经G418筛选后获得表达mIL-23的阳性细胞克隆(Colon26/IL-23).用PCR和RT-PCR检测目的基因的表达, 用ELISA法检测mIL-23的产生及mIL-23诱导的小鼠脾细胞IFN-γ的产生, 用MTT比色法检测Colon26/IL-23细胞和Colon26细胞的体外增殖.将Colon26/IL-23细胞接种于BALB/c小鼠的右侧背部皮下, 观察其致瘤性.结果: 建立了可表达mIL-23基因的小鼠结肠癌细胞株.分泌至培养上清中的IL-23, 可诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ.在体外Colon26/IL-23细胞的生长与Colon26细胞无明显不同, 但其在体内的致瘤性下降, 具有抗瘤作用.结论: Colon26/IL-23细胞可分泌IL-23并证明其具有抗瘤活性.
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针对Nogo-66受体分子不同抗体的反应性比较
目的: 比较几种不同的针对Nogo-66受体的抗体的反应性.方法: 利用Western blot技术, 用不同的NgR的抗体检测转染Flag-NgR或Flag-NgR H1/H2的COS细胞, 以验证NgR抗体的反应性和特异性; 利用间接免疫荧光染色技术, 检测不同的NgR的抗体对转染细胞以及颗粒神经元表达的NgR蛋白的反应性.结果: Western blot结果显示, AB5615、 sc-25659和NgRpAb都可特异识别NgR, 并且不和同源家族分子NgR H1/H2产生交叉反应; 转染Flag-NgR细胞的免疫荧光双标结果显示5种NgR的抗体均能与NgR产生特异反应, 其中仅Ngr11-A使核周NgR染色, 其余抗体可使胞膜和胞质均着色; CGN细胞荧光染色结果显示, 除Ngr11-A未观察到细胞染色外, 其余抗体均可使细胞的胞膜和突起特异着色, sc-16708和NgRpAb亦可使胞质着色.结论: 针对Nogo-66受体的这几种抗体都可以与NgR产生特异性反应; 不同NgR的抗体在Western blot和免疫荧光染色上的表现模式存在一定的差异.
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兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450scc抗体的制备、特性鉴定及应用
目的: 制备兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450侧链裂解酶(rP450side chain cleavage,rP450scc)合成肽片段的抗体, 并检测rP450scc在大鼠脑组织及神经细胞中的表达.方法: 利用多肽固相合成法(Fmoc法)合成对称的8分支16肽rP450scc多重抗原肽片段(rP450scc-16), 并以其免疫雄性新西兰兔制备抗rP450scc-16抗体.采用ELISA、 Western blot和免疫细胞化学染色法鉴定抗rP450scc-16抗体的特性.结果: 于末次免疫后5 d, 动脉放血分离血清, 用ELISA法检测抗rP450scc-16抗体的效价为1∶ 6 400.Western blot检测显示, 抗rP450scc-16抗血清与大鼠的脑、睾丸及肾上腺组织蛋白于相对分子质量为50 000处出现一条特异性的条带.用抗rP450scc-16抗体进行免疫细胞化学染色显示, 在正常大鼠的下丘脑、皮质、 海马等区及培养的胶质细胞胞质中均可见棕色颗粒.结论: 制备出高特异性的兔抗rP450scc-16抗体, 该抗体可检测rP450scc在正常大鼠脑组织中的表达和分布.
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人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定
目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)的单克隆抗体(mAb).方法: 以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基(SF-900Ⅱ)中, 通过BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统来表达NH-LBP.再以NH-LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH-LBP mAb的菌株并进行鉴定. 结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH-LBP, 经亲和纯化柱芯(TALON)有效纯化后, 获得约8 mg 的NH-LBP.成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5.0×108 CFU.经8轮筛选后, 抗体库被富集1.85×104倍.经ELISA法鉴定, 获得3株可产生抗NH-LBP mAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713, AY337714). 结论: 以昆虫细胞sf21表达NH-LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的.本研究为进一步建立抗NH-LBP的二硫键稳定的Fv抗体( disulfide stabilized Fv fragments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础.
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接种Aβ42全肽疫苗恒河猴的特异性体液免疫应答
目的: 观察恒河猴接种Aβ42肽疫苗后的特异性抗体的产生. 方法: 将5只雄性恒河猴分别在0、 2、 6、 10、 14、 18、 22 wk肌内注射Aβ42肽疫苗; 用ELISA法检测恒河猴血清抗Aβ42抗体水平及IgG亚类; 用Western blot检测血清抗Aβ42抗体的特异性; 免疫组化染色法观察抗血清对Tg2576转基因小鼠脑组织中Aβ斑的识别. 结果: 疫苗接种后第8周, 恒河猴血清中出现明显的抗Aβ42抗体, 抗体水平随着接种次数的增加而升高, 第24周达1∶ 4 320, 以后抗体水平开始下降.产生的抗Aβ42抗体以IgG1和IgG2为主(IgG2/IgG1>1).血清抗Aβ42抗体具有高度特异性, 可识别Tg2576转基因小鼠脑组织中的Aβ斑. 结论: Aβ42肽疫苗可有效地诱导恒河猴产生特异性体液免疫应答.
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抗禽流感病毒轻链抗体库的构建
目的: 构建抗禽流感病毒(AIV)抗体Fab轻链库,以便进一步构建完整AIV噬菌体抗体库.方法: 采用RT-PCR技术, 从经禽流感灭活油乳剂疫苗免疫的罗曼蛋鸡的外周血淋巴细胞中扩增抗AIV抗体轻链基因, 将扩增的抗体轻链基因与载体PComb3HSS连接后, 电转化入大肠杆菌XLI-Blue, 克隆筛选重组抗体Fab轻链基因的质粒, 并进行酶切鉴定和序列分析.结果: 扩增的AIV抗体轻链基因片段的大小约为617 bp. 经克隆筛选鉴定和序列分析证明, 获得抗AIV抗体轻链库, 该轻链库库容量为2.5×106, 轻链基因的重组率为50%.结论: 构建了库容量为2.5×106的抗AIV抗体轻链基因库, 为下一步构建鸡抗AIV噬菌体抗体库和筛选特异性的AIV Fab抗体奠定基础.
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兔抗MAGE-n血清的制备、纯化及鉴定
目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清.方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose 4B(CNBr-Activated Sephrose 4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、 ELISA、 Western blot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定.结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白.结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础.
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己烯雌酚免疫原的合成及其抗血清制备
目的: 制备人工合成的己烯雌酚(DES)的多克隆抗体.方法: 采用碳二亚胺法将DES与牛血清白蛋白(BSA)交联, 经紫外扫描估算其交联比为22, SDS-PAGE实验初步表明DES与BSA发生交联.用双向免疫琼脂扩散实验检测经DES-HS-BSA 多次免疫新西兰白兔的抗血清.结果: 合成的DES-HS-BSA复合物, 具有免疫原性, 并产生了针对小分子DES的抗体.结论: DES免疫原的合成是成功的, 为其试剂盒的研制提供了条件.
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从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体
目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL-8单链抗体(scFV).方法: 采用原核表达载体pRSET-IL-8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL-8-His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化.以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定.结果: 获得2株特异性抗IL-8噬菌体抗体.对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgG VH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群.结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL-8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件.
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白细胞介素12研究新进展
天然免疫和获得性免疫不是简单的相继和补充,而是通过细胞间接触和分泌可溶性介质彼此调节.天然免疫应答中产生的细胞因子指导T细胞向Th1或Th2细胞分化, 其中白细胞介素12(IL-12)特别引人注目.IL-12具有多种重要生物学活性, 参与机体免疫调节的许多方面, 是连接天然免疫和获得性免疫的功能性桥梁, 具有重要的抗感染、抗肿瘤作用.
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神经营养素受体p75NTR介导的信号转导
神经营养素(neurotrophin, NT)受体具有低亲和力的Mr为75 000 NT受体(75 KD NT receptor, p75NTR)和高亲和力的原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase, Trk)受体家族两类.二者均为跨膜蛋白受体, 参与调节以神经元为主的某些细胞的生长、分化、存活、修复以及凋亡等多种生物学效应.研究表明, 二者间的信号转导及生物学效应既相互协同又彼此拮抗, 既紧密联系又有显著区别.Trk受体一般介导"正性"信号, 如促进神经元生长、维持其存活; 而p75NTR则具有多种生物学效应, 除可促进神经元存活、生长外, 还可诱导神经元凋亡、抑制神经元轴突生长以及参与细胞周期的调节, 即可介导"正性"和"负性"两种效应, 但以介导"负性"促凋亡效应为主, 这与p75NTR所在细胞的类型、生理与功能状态、发育阶段以及局部环境有关.
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肾综合征出血热双价纯化疫苗的研制
目的: 研制肾综合征出血热双价纯化疫苗.方法: 肾综合征出血热病毒I型LR1株和II型R22株分别在Vero细胞上接种培养.I、 II型病毒培养液依次经β-丙内酯灭活、超滤浓缩、蔗糖区带离心纯化及层析脱糖等处理.将检定合格的I、 II型单价病毒原液等量混合后, 用AI(OH)3佐剂吸附, 制备3批双价纯化疫苗.结果: 该3批疫苗已经自检和中国药品生物制品检定所复检合格, 并已进行临床试验.结论: 采用Vero细胞培养制备肾综合征出血热双价纯化疫苗方法可行.
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卵巢切除对成年小鼠免疫系统淋巴细胞亚群组成的影响
目的: 研究卵巢切除对成年小鼠胸腺和外周淋巴器官淋巴细胞亚群组成的影响. 方法: 用双色免疫荧光结合流式细胞仪, 检测成年小鼠双侧卵巢切除14 d后, 胸腺、脾脏和腹腔淋巴细胞亚群的比例.结果: 与伪手术组相比较, 卵巢切除的成年小鼠胸腺CD4+ CD8+ T细胞的比率显著升高(P<0.05), CD4- CD8- T细胞和CD4+ CD8- T细胞的比率显著降低(P<0.05); 脾脏和淋巴结中CD4+ CD8- T细胞的比率显著降低(P<0.05).结论: 成年小鼠切除卵巢后, 可明显影响免疫系统淋巴细胞亚群的组成; 对于胸腺T细胞的发育及向外周输出也有一定的影响.
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雌孕激素对T淋巴细胞生长的调节作用
目的: 探讨雌孕激素对T淋巴细胞生长的调节作用.方法: 将不同浓度的雌孕激素加到Jurkat细胞中培养72 h, 用MTT法检测细胞增殖情况; 用DNA片断化分析细胞凋亡情况.结果: 不同浓度的雌孕激素对T淋巴细胞均有抑制作用, 并呈剂量依赖性; 凝胶电泳可见明显的梯状条带.结论: 雌孕激素对T淋巴细胞有直接的抑制作用并诱导细胞凋亡.
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PMA诱导的THP-1细胞分化过程中MMP-9及MMP-2的表达与细胞侵蚀性的关系
目的: 应用单核细胞THP-1株建立单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型, 并探讨THP-1细胞分化过程中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达与细胞侵蚀性的关系以及巨噬细胞在类风湿关节炎(RA)发病机制中的作用.方法: 用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA) 诱导THP-1细胞向成熟的单核-巨噬细胞分化后, 采用倒置显微镜观察分化细胞的形态学变化.用流式细胞术测定细胞表面特异性抗原CD14的表达.采用明胶酶谱(gelatin-zymogram)分析法测定分化前后THP-1细胞中MMP-9和MMP-2的表达.采用侵蚀性小室(Boyden Chamber-Matrigel人工重组基底膜)法, 观察分化前后的THP-1细胞侵蚀性的变化.结果: THP-1细胞向单核-巨噬细胞分化过程中, 细胞由分散、悬浮转变为黏附、贴壁, 且出现CD14的高表达.分化后的THP-1细胞中MMP-9和MMP-2的表达明显增多, 侵蚀性明显增强.结论: 建立了THP-1单核细胞的体外分化模型.该细胞在分化过程中, MMP-9和MMP-2的表达增多、侵蚀性增强, 为巨噬细胞在RA发病机制的作用提供了一定的实验依据.
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1表达的抑制作用
目的: 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对人外周血单个核细胞(PBMC)中TAP-1表达的影响.方法: 采用流式细胞仪(FCM)和半定量RT-PCR方法,从蛋白和mRNA水平上分析不同浓度的DON对体外培养的人PBMC中TAP-1分子表达的影响及量-效关系.结果: FCM定量检测表明, 用不同浓度的DON处理, 均可一定程度地抑制人PBMC中TAP-1蛋白的表达, 且二者呈显著的负相关(r=-0.865, P<0.01).半定量RT-PCR检测显示, 不同浓度的DON处理均可抑制人PBMC中TAP-1 mRNA的表达.结论: DON可剂量依赖地抑制体外培养的人PBMC中TAP-1蛋白和其mRNA的表达, 对阐明食管癌高发区被DON污染的粮食与食管癌发生的关系具有重要的意义.
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IL-2对辐射损伤后小肠上皮细胞生长影响的实验研究
目的: 观察电离辐射对体外培养的IEC-6细胞株生长的影响及IL-2对其损伤后增殖和恢复的作用, 并进一步探讨肠黏膜免疫与肠上皮辐射损伤及修复的关系. 方法: 用4、 8、 12Gy的γ射线照射IEC-6细胞株, 并于照后3、 6、 9、 12 h 及1、 2、 3 d, 用MTT比色法、光镜、电镜、 DNA凝胶电泳和流式细胞术等, 检测受照射后IEC-6细胞的增殖活力、 形态和死亡方式的改变; 用不同浓度IL-2(25×103、 5×104、 1×105U/L)处理8Gy γ射线照射的IEC-6细胞, 并于照射后3、 6、 9、 12、 24 h, 采用MTT比色法检测其增殖活力的变化.结果: 在0～12Gy的范围内, IEC-6细胞的增殖活力随γ射线照射剂量的增加而降低.8.0 γ射线照后24 h, 凋亡的IEC-6细胞明显增多, DNA凝胶电泳显示有梯状带形成.IL-2可促进照射后的IEC-6细胞增殖且呈一定的剂量-效应关系, 尤以1×105U/L组的作用更明显.结论: 在一定剂量范围内, γ射线照射可降低IEC-6细胞增殖活力, 且存在剂量-效应关系; 可导致IEC-6细胞发生凋亡.IL-2可促进受照射的IEC-6细胞增殖, 增强其抗辐射的作用.
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人类白细胞分化抗原CD命名的新进展
第8届国际人类白细胞分化抗原专题讨论会(HLDA8)于2004年12月12～16日在澳大利亚阿德莱德召开.会议给115种分子及其相应单克隆抗体(mAb)命名了111个CD/CDw编号, 其中有3类分子(SIRP、 IL-18R和CMRF35 family)的不同成员分别共享同一CD编号, 并用小写英文字母表示其同一CD(或CDw)编号中的不同成员.这次新命名CD数是为历届HLDA之, 总计CD的编号已达到CD339, 充分反映了自HLDA7 4年多以来新的免疫膜分子及其mAb制备的研究进展.
| 年 | 期数 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 z1 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 |
| 1995 | 01 02 03 |
| 1994 | 01 02 |
| 1993 | 01 02 03 04 |
| 1992 | 01 02 03 04 |
| 1991 | 01 02 03 04 |
| 1990 | 01 02 |
| 1989 | 01 02 03 04 |
