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siRNA和miRNA及其抗病毒的研究近况
近年来,随着siRNA和miRNA的发现,二者的关系正逐渐被深入研究,而二者的应用更成为探讨的热点.针对siRNA和miRNA的关系和应用,本文介绍了siRNA和miRNA的形成和生物学效应并从生化特征、功能和生源论等方面对二者进行比较,以及在此基础上,着重概括了siRNA和miRNA在抗病毒治疗方面的研究近况.
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RNAi技术用于丙型肝炎治疗的研究进展
1989年,美国学者Choc等用分子克隆技术获得了丙型肝炎病毒(HCV)的基因克隆并为其命名.如今,HCV感染引起的丙型肝炎由于流行性强,危害性大,已经引起了人们越来越多的重视.全球感染HCV的人数有1.7亿之多,各国感染率在0.1%～10%,感染后80%～85%的患者转为慢性感染,由于多数无明显症状,不易早期诊断和治疗,致使患者病情缓慢加重,甚至导致肝硬化、肝癌等严重疾病.目前对于丙型肝炎抗病毒治疗主要是用干扰素药物,但其效果均不甚理想.
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RNA干扰抗人单股正链RNA病毒感染的研究进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种新兴的高效基因沉默工具,用于研究基因功能与基因表达调控领域,特异性地降低或关闭目的基因表达.近年来,针对病毒感染性疾病,尚无特别有效的防治方法.目前RNAi技术被广泛应用于抗病毒感染领域的研究,几种以RNAi为基础的抗病毒疗法目前正在进行不同时期的临床试验[1],有望成为抗病毒感染基因治疗的有效工具.
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抗丙型肝炎病毒siRNA分子肝靶向性研究进展
抗丙型肝炎病毒(HCV)siRNA体内使用大障碍在于缺乏稳定、有效、安全的肝靶向转递手段,表现在血浆半衰期短,生物分布广泛,细胞摄取困难及潜在的非靶基因沉默等副反应.siRNA肝靶向修饰可以增加肝细胞摄入量,减少非特异性生物分布,减少用药量,降低副反应,并一定程度增强稳定性.本文分析了非载体类siRNA肝靶向研究现状,并试图提出未来研究的发展方向.
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RNA干扰--治疗HIV感染的新方法
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的,特异性沉默内源或外源性同源基因的过程.RNAi的分子生物学特征当前已被用于抗HIV感染和治疗AIDS病.本文就RNAi抗HIV机制和近两年来RNAi在抗HIV-1感染方面的新研究进展及在RNAi实验设计上需注意的问题等方面加以综述.
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乳糖酸修饰壳聚糖载体与siRNA结合体外稳定性研究
基因载体系统是实现基因转导和基因治疗的关键,壳聚糖作为一种安全、无毒、可降解的阳离子基因治疗栽体受到越来越多的关注.本实验研究具有靶向作用的乳糖酸修饰壳聚糖体外与siRNA佳结合质量比及稳定结合条件.结果发现修饰后的壳聚糖能结合的siRNA量减少,pH及盐浓度对乳糖酸修饰壳聚糖与siRNA结合的稳定性均有影响.本实验为壳聚糖的靶向提供思路,并为乳糖酸修饰壳聚糖载体基因治疗制剂提供实验指导.
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下调E2-EPF水平对宫颈癌Caski细胞生物学行为的影响
目的 探讨下调泛素结合酶E2-EPF对宫颈癌细胞株Caski细胞增殖、细胞周期及对放、化疗效果等方面的影响. 方法 采用RNA干扰技术下调Caski株E2-EPF的表达后,采用流式细胞术、MTT细胞增殖实验方法研究E2-EPF低表达对Caski株细胞生长速率的影响;通过不同剂量X线照射及常用化疗药物作用后,检测细胞凋亡及细胞增殖情况,了解下调E2-EPF对放、化疗的影响. 结果 通过瞬时转染E2-EPF-siRNA质粒载体,Caski株细胞内E2-EPF的mRNA水平下降至对照组的5％左右,其相应蛋白水平低至难以检出;与对照组相比,E2-EPF低表达Caski株细胞生长速率明显减低(P＜0.05),对拓扑替康和依托泊苷药物的敏感性明显增强(P＜0.05),但对放疗效果无明显影响(P＞0.05). 结论 E2-EPF参与宫颈癌细胞株Caski的生长调控,瞬时下调E2-EPF可以抑制肿瘤细胞生长、增强细胞对拓扑异构酶Ⅰ抑制剂和拓扑异构酶Ⅱ抑制剂类化疗药物的敏感性.
关键词： 泛素结合酶E2-EPF siRNA 宫颈癌 Caski 拓扑异构酶抑制剂 -
siRNA沉默CHD6基因表达对细胞增殖和辐射敏感性的影响
目的通过建立siRNA介导的染色质重构蛋白CHD6基因表达抑制的细胞模型,研究CHD6对人肺腺癌细胞A549细胞增殖及辐射敏感性的影响.
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VEGF siRNA致中国仓鼠肺细胞染色体畸变的研究
目的 研究VEGF siRNA对中国仓鼠肺细胞(CHL)的染色体畸变作用.方法 采用25、50和100nmol/L的VEGF siRNA转染中国仓鼠的肺细胞,分别观察24h、48h后的染色体畸变情况.结果 在VEGFsiRNA转染24小时,仅100nmol/L VEGF siRNA产生可疑阳性反应,其染色体的畸变率为6％；在VEGFsiRNA转染48小时后,50nmol/L的VEGF siRNA和100nmol/L的VEGF siRNA均产生可疑阳性反应,染色体的畸变率分别为6％和10％.而25nmol/L的VEGF siRNA无论是在转染后24h还是48h,均未产生染色体的畸变作用.VEGF siRNA产生的染色体畸变类型有断裂、双着丝粒、多倍体、裂隙、三射体.结论 100nmol/L的VEGFsiRNA分子可引起CHL细胞产生染色体畸变.
关键词： 血管内皮生长因子 VEGF siRNA 中国仓鼠肺细胞(CHL) 染色体畸变 -
bax基因siRNA序列的筛选及其对铝致神经胶质瘤细胞凋亡的影响
目的 应用RNA干扰技术降低促凋亡基因bax的表达,以阻抑铝诱导的神经胶质瘤细胞凋亡.方法 设计了3对阻抑bax基因表达的siRNA序列,对神经胶质瘤细胞进行了转染,根据不同siRNA序列在不同转染剂量、不同转染时间的细胞活力,找到bax siRNA转染的佳转染剂量和适转染时间.依据RNA干扰前后bax基因的表达变化筛检出有效的siRNA序列.用荧光染色法、荧光定量PCR法和免疫组织化学染色法分别检测其转染效率、对基因表达的干扰效率及对蛋白表达的阻抑效应.结果 有效的针对bax基因的siRNA序列为siRNA1,该序列的转染效率90%,时bax基因表达的干扰效率为62.3%.佳转染后检测点为转染后72h,适转染剂量为20nmo/L.结论 阻抑bax基因表达的siRNA序列能有效干扰bax基因和蛋白的表达,降低凋亡率.
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NF-KappaB SiRNA修饰树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受诱导的研究
目的:探讨NF-KappaB(NF-κB)SiRNA修饰供体树突状细胞(DC)对异基因大鼠间皮肤移植术后免疫耐受诱导的效果,从而为该基因治疗方法应用于临床皮肤移植提供依据.方法 1.PGPU6/GFP/Neo-siRNA–NF-κB 表达载体的构建.2.体外SD大鼠骨髓干细胞体外定向诱导扩增培养DC后,将 NF-κB SiRNA及阴性对照SiRNA以LipofectamineTM2000 转染入大鼠DC,行 RT- PCR 和Western blot 检测.3.NF-κB SiRNA转染的DC 2×106个/只经尾静脉注入受鼠体内,分为对照组,未修饰DC组,NF-κB SiRNA基因修饰DC组,5天后行皮肤移植,移植5天后部分受鼠移植皮肤送病理检测,其余观察皮肤存活时间,TUNEL法检测移植皮肤淋巴细胞调亡情况.结果 构建的PGPU6/GFP/N-eo-siRNA-NF-κB通过脂质体转染到DC后,能明显抑制NF-κB基因和蛋白的表达.目的基因修饰组皮肤移植存活情况明显优于其它两组.结论 PGPU6/GFP/Neo-siRNA–NF-κB表达载体成功转染DC.NF-κB SiRNA修饰的供体DC预处理受体(经尾静脉注入),可明显延长移植皮肤的存活时间.
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SiRNA靶向干扰survivin基因对舌癌细胞系Tca8113 侵袭性的影响
目的 应用RNAi技术抑制人口腔鳞癌细胞株Tca8113中survivin基因的的表达,观察survivin基因对Tca8113细胞增殖与凋亡的影响.方法 化学合成靶向人类survivin基因的特异性siRNA,将其转染至Tca8113细胞中,采用RT-PCR法检测转染后Tca8113细胞中survivin的mRNA表达,应用MTT方法检测细胞的增殖状况,采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况.结果 survivin靶向siRNA转染细胞后survivin基因的mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞增殖能力降低,凋亡增多.结论 通过RNAi技术阻断Tca8113细胞survivin基因的表达可抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡.
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小RNA在精子发生中的研究进展
近20年来人们在动物、植物及病毒等生物中发现了一系列小分子非编码RNA,包括miRNA[1]、piRNA[2]和siRNA[3].与其相关的Argonaut家族蛋白分为2个亚家族:Ago亚家族和Piwi亚家族.精子发生是指由精原细胞经初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞至成熟精子形成的过程.整个过程分为3个阶段:精原细胞的增殖、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变态过程,这一复杂的过程受多种因素的调控.近年来,小RNA在精子发生中的作用越来越受到人们的重视,现将三种小分子非编码RNA在精子发生中调控作用的研究现状概述如下.
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ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体.方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRN cDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定.结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确.结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础.
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化学合成小干扰RNA体外转染大鼠支持细胞的实验研究
目的:观察化学合成siRNA阻断大鼠支持细胞内源性基因表达的可行性,并优化转染条件.方法:体外取SD大鼠睾丸,分离、培养支持细胞,应用化学合成的不同浓度siRNA在阳离子脂质体Lipofectamice TM 2000介导下转染原代支持细胞.RT-PCR检测大鼠支持细胞中GAPDH mRNA水平的变化,MTT法检测支持细胞的活性.结果:转染终浓度为150nmol/L的siRNA能特异性有效的阻断GAPDH基因的表达,细胞毒性随浓度提高而增强,终浓度为200nmoL/L的siRNA对细胞有明显毒性.结论:siRNA能在大鼠支持细胞内启动RNA干扰,150nmol/L的siRNA能特异有效地阻断内源基因表达并保持较高的细胞活性.
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siRNA抑制结肠癌细胞livin基因凋亡
目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默livin基因在结肠癌细胞中的表达情况,探讨livin基因对结肠癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计针对livin基因的两条siRNA表达载体并转染至生长期的结肠癌细胞中,筛选后采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、MTT、TUNEL分别比较检测转染前后结肠癌细胞livin基因的表达.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组的livinα/β mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05);但转染siRNA组Livin1/2 mRNA表达显著降低,明显低于siRNA对照组和空siRNA载体组(P＜0.05).细胞生长曲线测定经F检验三组间无显著性差异.转染siRNA载体沉默livinα/β表达,细胞凋亡率显著增加.结论:siRNA沉默livin基因能抑制结肠癌细胞的生长,促进结肠癌细胞的凋亡.
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LIMK1-siRNA真核载体的构建及在人软骨细胞中的蛋白表达
目的 构建LIMK1-siRNA真核表达载体,为骨关节发病机制的研究奠定基础.方法 合成3条LIMK1的小RNA分子的寡聚脱氧核苷酸链,重组质粒测序,瞬时转染人软骨细胞,采用Western blot检测LIMK1表达情况.结果 Western blot检测LY3号质粒的细胞中LIMK1蛋白表达明显下调,经通用引物对LY3号重组质粒测序鉴定,与设计序列核对完全相符.结论 成功构建LIMK1-siRNA真核表达载体,有效沉默了人软骨细胞中LIMK1蛋白表达.
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RNA干扰作用机制及其在中医药研究中的应用前景
RNA干扰首先由Su Guo博士于1995年在秀丽新小杆线虫体内发现,而后发现这一现象广泛存在于自然界各级生物体当中.RNAi作用机制涉及siRNAs及miRNAs的产生、RISC的装配、RISC的功能三个过程从而沉默目的基因的表达.在中医药研究中,RNAi这一复杂现象的作用机制完全可以用中医理论的阴阳学说来解释,而且它在证候-基因组研究、中药作用的靶标或阐明中药的作用机制、中药的毒性研究等方面都有重要的应用前景.
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化学合成siRNA抑制H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖
为研究RNA干涉对H5N1亚型禽流感病毒的增殖抑制作用,针对H5N1亚型禽流感病毒的NP和PA基因,设计4对siRNA干涉序列,并将其转染到鸡胚成纤维细胞,6h后接种H5N1亚型禽流感病毒液,在病毒感染后的16～56h内测定细胞上清中的病毒血凝价及观察细胞病变,并在病毒感染36h后检测NP、PA、HA和β-actin基因的mRNA水平.结果显示4对siRNA均能不同程度地抑制H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖,但以PA为靶基因设计的一对干涉序列效果优；实验还证实随着时间的延长,干涉效应逐渐减弱.本实验为研究RNA干涉技术防控禽流感提供了依据.
关键词： siRNA H5N1亚型禽流感病毒 鸡胚成纤维细胞 增殖 -
表达禽流感病毒特异性siRNA分子减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建
为了寻找一种新的短干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)片段的表达和递送系统,并进行评价,根据禽流感病毒核苷酸序列,设计了3条分别针对A型禽流感病毒核衣壳蛋白、聚合酶A和H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性siRNA分子,人工合成相应DNA片段,退火后形成双链,与阴性对照片段分别连接到构建的pSIREN-ASD ZsGreen载体鼠源U6启动子下游,测序鉴定证实获得了阳性质粒,分别命名为PAZ-NP、PAZ-PA、PAZ-HA和PAZ-NC,1ng的质粒可以完全抑制50个PFU的禽流感病毒在MDCK细胞上的复制,细胞不产生任何病变,细胞上清的血凝效价为2°,而对照组细胞在病毒感染36～48h后细胞变圆、死亡、脱落,其细胞上清的血凝效价可达24.将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到重组沙门氏菌X4550(PAZ-NP)、X4550(PAZ-PA)、X4550(PAZ-HA)和X4550(PAZ-NC).对4日龄雏鸡口服1×109菌落形成单位(CFU)的重组菌后第1d、7d、15d用105ELD50的H5亚型AIV进行攻毒,后一次攻毒后观察15d,实验结束时采泄殖腔棉拭子对存活鸡进行病毒分离.结果表明,表达不同的siRNA分子对雏鸡有一定的保护力,保护率为27%～50%不等,存活鸡泄殖腔棉拭子未分离到病毒,说明重组减毒沙门氏菌携带质粒在体内产生的siRNA能够对机体产生一定保护力.
