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一株HIV1变异株的发现
我们在进行序列分析过程中发现一株不同于以往国内外报道的新型HIV1的变异毒株。现报道如下:1 材料和方法1.1 前病毒DNA的提取某HIV1感染者300μLEDTA抗凝血,使用Promega公司的DNA提取试剂盒(Wizard GenomicDNA Purification Kit)提取HIV1前病毒DNA。1.2 HIV env基因c2-v3区的套式PCR扩增 以所提的HW1前病毒DNA为模板,利用一对外侧引物EP1,EP2(序列为,EP1:5'-GGCAGTCTAGCA-GAAGAAGAGG-3':EP2:5'-CCTACTTC-C TGCCACATG-3')和一对内侧引物EP3,EP4(序列为,EP3:5'-GATCTGA-CAATTTCACGAACAAT TGC-3';EP4:5'-C TGGGTCCCCTCCTGAAGGATG-3')进行nested-PCR反应。反应条件为94qC30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃C5min结束扩增。1.3 PCR扩增片段的克隆P CR扩增的特异性片段经Promega公司的PCR产物纯化试剂盒(WizardPCRprepsDNA pu-rification system)纯化后,与PGEM-T载体连接克隆于JM109宿主菌中
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RT-PCR检测不同人群庚型肝炎病毒感染
为了解成都地区HGV感染情况,我们采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)对职业献血员、健康自然人群和急慢性肝炎病人进行了检测。 1 材料和方法 1.1 对象成都职业献血员165名,各项体检均合格。成都键康自然人群406名,A~E肝炎血清标志均阴性,ALT正常。肝炎病人包括急性甲型肝炎32人,急性乙型肝炎87人,慢性乙型肝炎95人,慢性丙型肝炎23人,非A~E肝炎18人,这些病人均用酶联免疫吸附试验(ELSA)(上海科华试剂)测定血清病毒抗原/抗体证实。 1.2 HGV引物据5'-NCR和NS5α区设计引物和捕获探针[2],由北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。5'-NCR区扩增位于100-285核苷酸片段,NS 5α区扩增位于6 904-7 059核苷酸片段。
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戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒RNA的动态观察及意义
目前,国内外对戊型肝炎(HE)患者病毒血症已有研究,各家报道有明显不同,我们采用逆转录-聚合酶链反应方法检测32例HE患者系列血清,探明HE患者病毒血症持续时间和消长规律。 检测对象为中国医大二院传染科1995年1月至1996年10月期间住院患者32例,临床诊断为戊型肝炎。分别收集患者病后0~7 d、8~14 d、15~12 d、22~28d系列血清共125份,用异硫氰酸胍一步法抽提HEV RNA。引入一对外引物序列为:外正向引物(4459-4478)5'- GCATTATGGA GGAGTGT GG-3',外反向引物 (4877-4858)5'- CCAGG GCCC-CAATTCTTG-3',一对内引物序列为:内正向引物(4522--4539)5'-GCGTG-GATCTTGCAGGCC-3',内反向引物(4741-4760)5'-TTCAACTTCAA GCCACA GCC-3',进行2次PCR扩增。
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超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究
按质粒所携带编码基因同源性的不同,将超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)分为4类,即TEM型、SHV型、TEM/SHV混合型和非TEM/非SHV型(包括PER、TOHO、CTX-M、OXA型等)。本文报告绍兴地区产ESBLs细菌基因分型的初步结果。 临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ESBLs的细菌42株(其中大肠埃希菌26株,肺炎克雷伯菌16株)。用PCR进行酶基因分型。PCR扩增引物,根据TEM-1和SHV-1编码基因序列设计,TEM引物序列分别为:5′-TCGGGGAAATGTGCG-3′和5′-TGCTTAATCAGTGAGGCACC-3′;SHV引物为5′-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3′和5′-TCCCGCAGATAAATCACCA-3′。待测菌株用碱裂解法提取质粒DNA。PCR反应体积为100μl,含1×PCR反应缓冲液,3.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dNTPs,500μmol/L引物,1.6U Taq酶(Promega),10~100ng质粒DNA模板。
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人巨细胞病毒UL57基因原核表达克隆的构建、表达及初步纯化
现有的IgM血清学试验对HCMV的诊断存在敏感性和特异性较差问题,其主要原因是迄今采用的抗原仍为从纯化的病毒颗粒中提取的病毒抗原性物质或粗提的病毒全抗原成分。近几年来人们致力于探讨能替代HCMV全病毒抗原的基因工程抗原,以完善IgM特异性血清学试验。本文通过构建HCMV DNA结合蛋白的一段基因的原核表达克隆,从而对表达产物的抗原性进行初步分析。 通过Oligosis软件设计UL57基因(aa540~604)两端引物,并在引物的5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶识别序列及保护位点。引物序列如下:P1:CTGGGATCCCCCAAAGGTGACGAC P2:GTGAATTCTCAGCGATTGAGGA。从感染的人胚肺成纤维细胞中提取和纯化HCMVAD169基因组,以纯化的核酸为模板,加入PCR反应体系进行UL57基因的扩增。
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乌鲁木齐市部分高危人群庚型肝炎病毒感染现状及5′ UTR区基因序列分析
新疆地处我国西部边陲,存在着各型肝炎散发流行的危险因素,庚型肝炎病毒在乌鲁木齐市的流行现状尚未见报道.在新疆医科大学第一附院收集了267份各类人群的血清,用酶标法检测血清中庚型肝炎病毒抗体(抗-HGV),再以庚型肝炎病毒NS3区为引物运用RT-PCR法对抗-HGV(阳性)血清进行庚型肝炎病毒核酸(HGV RNA)的扩增检测,阳性扩增产物为83bp.后,选择该病毒5′非编码区为引物对第一次RT-PCR扩增HGV RNA(阳性)血清,再次进行
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通用引物检测脑炎患者脑脊液疱疹病毒DNA及其酶切鉴定
疱疹病毒(HSV)引起的脑炎不经治疗死亡率高达70%, 若获早期诊断治疗, 死亡率可降至(19~28)%[1].临床迫切需要快速、特异、敏感的诊断方法.90年代后, 陆续有用PCR对病毒性脑炎作病原诊断的报道,但用通用引物检测病人脑脊液(CSF)中疱疹病毒DNA的报道并不多见.我们选择疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因高保守区一对引物,对中枢神经系统(CNS)感染病人CSF作PCR扩增和病毒分离,以研究病毒性脑炎的快速诊断方法.
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血清HIV抗体阴性静脉药瘾者肝组织HIV DNA测定
为评估HIV抗体阴性HIV感染高危人群潜在的HIV传播性,本研究对来自德国的38例HIV抗体阴性的静脉药瘾者肝组织样品进行常规DNA抽提,用HIV不同结构区(gag,pol,env)6对引物同时扩增HIV DNA。结果发现38例肝组织中有30例在HIV gag区(M667/sk03c,M661/sk01c)发生特异性扩增。10例对HIV env区(env526/C02,envC01/571K)发生特异性扩增。进一步分析发现38例中有3例同时在gag、pol、env 3个区域产生特异性扩增,12例分别对HIVgag和pol区或gag、env区产生特异性扩增,17例产生单一gag或pol或env特异性扩增,6例在gag、pol、env区均阴性。对env阳性的部分标本经荧光标记自动测序仪测序并与国际HIV标准株比较,其感染HIV株与欧美B亚型同源性为86%。此研究提示,抗HIV阴性的静脉药瘾者为潜在HIV感染的高危人群,加强对这类人群“窗口期”的监测,对预防HIV的传播有重要意义。
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HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验
1995年,美国Simons等和Linnen等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)的基因组,并建立了检测血清GBV-C/HGV RNA的逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法.但是,该检测方法的灵敏度存在着较大差异.本实验使用A~E共5套PCR引物,基中A、B、D为自行设计的HGV 5′端非编码区引物,目的产物长度分别为368bp, 158bp及220bp;C引物为参照文献设计的核心区引物,目的产物为302bp;E引物为李倬副研究员设计的NS3区引物,目的产物长度为591bp.采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HGV RNA,套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR).
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微阵列技术诊断神经系统细菌感染
微阵列技术以高通量、大规模、微型化和平行化的显著特点,已越来越多地应用于人类疾病诊断.我们在细菌的16S rRNA基因内设计了一套保守的通用引物,并对脑脊液常见病原菌各设计了2条特异性探针,建立了膜微阵列技术平行检测脑脊液病原菌DNA的方法,在对标准菌株进行检测鉴定的基础上,又对34株脑脊液临床分离株进行了鉴定,其结果可靠,而且仅用5?h即可鉴定出菌种,具有一定的现实意义.
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套式RT-PCR方法检测SARS冠状病毒
采用世界卫生组织推荐的套式RT-PCR引物,建立了较稳定、重复性好的实验室检测方法.病理检测的肺组织3份,取自广州非典死亡病例;咽拭子和漱口水20份,取自广州非典临床确诊病例;SARS冠状病毒,本室保存.Vero-F6、大肠杆菌DH5α为本实验室保存.
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软叶针葵花粉肌动蛋白抑制蛋白基因的克隆表达与纯化及免疫学鉴定
花粉是主要的吸人性过敏原之一.软叶针葵是一种热带、亚热带常见植物,在授粉季节所产花粉量较大,具很大的过敏潜能.但目前国内外尚鲜见软叶针葵花粉过敏原研究的报道.本研究用简并性引物从软叶针葵花粉中获得1个肌动蛋白抑制蛋白(profilin)基因,并在大肠杆菌中进行表达,获得有活性的重组profilin,同时研究其免疫学特性,并为软叶针葵花粉过敏诊断及免疫学治疗奠定基础.
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等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价
载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)是血浆主要载脂蛋白之一,具有明显的遗传多态性,3种常见的等位基因(ε2、ε3、ε4)分别编码3种主要异构体(E2、E3、E4),产生6种不同的基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4).apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素,而且与Alzheimer病密切相关.目前国内外检测apoE基因多态性的方法很多,因而快速简便的检测方法也就成为研究中关注的焦点.等位基因特异性多重聚合酶链反应(PCR)技术(multi-ARMS)是利用TaqDNA聚合酶对引物3′端核苷酸的特异性,在不同的反应体系中分别加入与待检测位点野生型、突变体相配的一对引物,通过扩增产物的有无来判定该位点是否突变.
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应用基因芯片技术检测20种病原菌的探讨
本研究根据细菌16S rRNA基因的特点[1],设计了一套保守的通用引物,并针对每种细菌各设计了两条特异性探针,建立了膜芯片技术平行检测病原菌DNA的方法.
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嗜麦芽窄食单胞菌的分子流行病学研究
嗜麦芽窄食单胞菌感染多发生在机体免疫受损、肿瘤患者以及器官移植患者中.不合理使用广谱抗生素、有创性治疗,均是该菌感染发生率增加的因素.因此,有必要对该菌进行分子流行病学研究.对细菌同源性、耐药性研究中,与复杂的脉冲凝胶电泳相比,肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR),亦不失为一种简便、可靠、重复性好、分辨率高的分子生物学方法[1-3].一、材料与方法
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嗜麦芽窄食单胞菌在重症病房的流行
嗜麦芽窄食单胞菌(S.ma)为条件致病菌和医院感染菌[1].我们采用简易快速的三管法和API方法对临床分离的34株S.ma进行鉴定,并采用肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行DNA分型.
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应用多重聚合酶链反应检测致病性霍乱弧菌
本研究分别针对霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW)和肠毒素A亚单位基因(ctxA)设计引物,建立的多重聚合酶链反应(PCR)方法,可准确地将产毒霍乱弧菌与非产毒霍乱弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、志贺菌、沙门菌和致病性大肠埃希菌加以鉴别.
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疱疹类病毒特异性酶切图谱的建立和初步应用
目前,对疱疹病毒感染仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法.本研究用通用引物,对单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型(HSVⅠ/Ⅱ)、爱泼斯坦-马尔病毒(EBV)、人巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人类疱疹病毒6型(HHV6)作聚合酶链反应(PCR)扩增,选用BamHI和BstUI酶切,以建立疱疹类病毒特异性酶切图谱,并初步用于临床.
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两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究
我们比较了结核分枝杆菌(结核菌)基因组DNA及其聚合酶链反应(PCR)产物的灵敏度与特异性,并对结核病人痰标本进行了检测。 一、材料和方法 1.菌种来源:24种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。 2.标本收集:90份痰标本来自本院结核科住院病人,经X线检查、临床表现确诊。30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。 3.标本DNA提取:采用本室研制的标本前处理试剂盒。 4.引物:引物a:根据文献[1]报道设计。扩增产物为350 bp,5′-GAAGTCGTAACAAGC,5′-CAAGGCATCCACCAT;引物b:根据引物a扩增产物测序结果,选择碱基差异性设计,扩增产物为250 bp,5′-CGGCAGCGTATCCATTGATG,5′-CACGAAAACGCCCCAACTG。 5.PCR扩增:引物a扩增参数:94℃,1 min;45℃,3 min;72℃,1 min;循环30次,后72℃延伸10 min。引物b扩增参数:94℃,1 min;61℃,1 min;72℃,1 min;循环30次,后72℃延伸10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
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用萘啶酸预测大肠埃希菌gyrA基因突变的探讨
近年来,大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率上升明显,其对喹诺酮类药物耐药性的产生主要与染色体gyrA基因突变有关[1],而它的突变过程是渐进的,即首先发生单基因位点突变,此时菌株对环丙沙星仅表现为敏感性下降.如在药物继续作用下,则极易发生双基因或多基因位点突变[2],表现为高度耐药.如能检出单基因位点突变菌株对防止大肠埃希菌演变成耐药菌有重要临床意义.目前检测gyrA基因突变均采用分子生物学方法,如聚合酶链反应(PCR)、基因测序等,无法作为常规方法.为此,我们用萘啶酸预测gyrA基因突变进行了探讨,现报告如下.一、材料与方法1.菌株:从病房和门诊病人送检标本分离63株临床菌株,其中对萘啶酸、环丙沙星均敏感24株;萘啶酸耐药、环丙沙星敏感或低水平耐药17株;萘啶酸、环丙沙星均耐药22株.1株标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922,萘啶酸、环丙沙星均敏感.2.药敏采用纸片扩散(K-B)法:药敏纸片、M-H培养基均为OXOID产品.药敏结果按美国临床实验室标准化委员会1999年标准判断.3.基因检测:PCR扩增,喹诺酮类耐药决定区(QRDR)引物按文献[3],引物1为5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′,引物2为5′-CCGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3′,由中国军事医学科学院合成;Hinf