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端粒、端粒酶与消化系肿瘤
端粒 端粒(telomere)是位于染色体末端的一段DNA。早在30年代Muller和Clintock就发现染色体末端的这一特殊DNA序列,具有稳定染色体的功能。若缺少之则染色体出现降解、重排、丢失、染色体间出现端—端融合等变化,从而影响DNA正确复制及细胞的生存。真核细胞DNA是线性DNA,当其沿5′→3′方向复制时,模板DNA起始端先与引物RNA互补结合,随之新合成DNA链延伸,当DNA聚合后,引物RNA脱落,其空缺处的模板DNA无法再复制成双链,故每复制一次,末端DNA就丢失若干个端粒重复序列(50~200核苷酸),此即真核细胞分裂中的“末端复制事件”。
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氟达拉滨在淋巴细胞白血病治疗中的应用
氟达拉滨(fludarabine,Flu)是一种具有淋巴毒作用的抗代谢类药物,其作用机制是掺入肿瘤细胞的DNA链或RNA链,阻止链的延伸,抑制DNA、RNA的生物合成;同时还可抑制DNA和RNA聚合酶、DNA的引物酶、DNA螺旋酶和核糖核酸还原酶的活性.Flu早用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的治疗,后又用于难治复发急性髓细胞白血病(AML)的治疗,均取得较满意疗效.近年来,国外陆续文献报道将其单用或与其他药物联合应用于难治复发急性淋巴细胞白血病(ALL)病人的治疗,现将其在淋巴细胞白血病治疗中的应用进行综述.
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云南鼠尾草SSR位点信息分析和引物初筛
目的 初步从滇丹参转录组文库中筛选出EST序列简单重复序列(SSR)位点,为进一步筛选出多态性丰富的SSR引物奠定基础.方法 使用Micro SAtellite (MISA)软件分析滇丹参高通量转录组SSR的分布频率和重复基元的类型特征,利用软件Primer3设计引物,实现SSR引物初次筛选,再使用PCR扩增技术对滇丹参SSR引物进行二次筛选.结果 40对引物共有25对出现特异性扩增片段,其中20对扩增产物与预期产物相符度较高.结论 利用初步筛选出可用的SSR分子标记,为下一步筛选出多态性丰富的SSR引物奠定基础.转录组SSR分子标记开发将有助于滇丹参遗传多样性的研究.
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成纤维细胞生长因子信号持续增高对体外培养的骺板软骨细胞发育的影响
我们以体外培养的软骨细胞为对象,观察持续的大剂量应用成纤维细胞生长因子(FGF)对软骨细胞发育的影响.一、材料和方法1.材料:出生后第4天的C57BL/6J小鼠72只,雌雄未分,碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)、肝素钠、Ⅱ型胶原蛋白酶.胰蛋白酶、DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素.Trizol、The Cells-to-cDNA Ⅱ 试剂盒、TaKaRa聚合酶链反应(PCR)Amplification试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒、实时定量PCR( Real-time PCR)引物.
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四跨膜蛋白CD151下调E-cadherin促进肝癌侵袭转移的研究
本研究旨在探讨CD151与上皮间皮转化重要标记E-cadherin两者在肝癌中的关系,现报道如下.一、资料与方法1.材料:细胞株购自中国科学院上海生物所.pGCSIL-shRNA-CD151、pGCSIL-cDNA-CD151由复旦大学附属中山医院肝癌研究所樊嘉教授惠赠[1].引物由上海申能博彩生物有限公司合成.
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蛋白质酪氨酸磷酶在肝癌内的表达及意义
蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)D1基因是通过同源保守序列设计的引物扩增人骨骼肌细胞株构建cDNA文库,得到同一家族片段,均为PTP家族基因[1,2].目前PTPD1在食道癌、结肠直肠癌中表达[3,5],但在肝癌中表达的情况,目前尚未见报道.我们应用Northern blot分析PTPD1基因在肝癌组织及相应癌旁肝组织中的表达情况,以探讨PTPD1基因在肝癌发生、发展中的作用.
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抗人VEGF发卡状核酶对肝癌细胞SMMC-7721生物学特性的影响
我们设计了针对VEGF的发卡状核酶,观察其对肝癌细胞生物学特性的影响.一、材料和方法1.主要试剂和细胞系:Lipofectamine、G418购自Gibco公司;UNIQ柱式总RNA抽提试剂盒购自上海Sangon生物技术有限公司;人VEGF ELISA检测试剂盒购自晶美公司;人肝癌细胞系SMMC-7721由本室保存;引物由上海Sangon生物技术有限公司合成.
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特异扩增法检测大肠癌淋巴结微转移突变等位基因的研究
我们设计用K-ras基因第一外显子(12/13密码子)和结肠腺瘤性息肉(APC)基因突变聚集区(MCR)引物,采用多基因聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和突变等位基因特异扩增(MASA)法对60例大肠癌的癌组织及突变病例所属常规病理检查转移阴性的淋巴结进行联合检测,探讨癌基因检测淋巴结微转移的途径及意义,并经DNA序列分析证明了此方法学的可靠性.
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血管抑素K(1~3)基因片段的克隆与序列测定
我们用自己设计的一对引物,应用PCR法成功获得血管抑素(angiostatin)K(1~3)基因片段,为进一步研究其表达和实体瘤抗血管生成治疗创造条件,现将结果报道如下.
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血型糖蛋白AcDNA的克隆及其酵母双杂交系统BD端pGBkT1-GPA质粒的构建
目的:检测红细胞膜跨膜蛋白质--血型糖蛋白A(GPA)对酵母细胞是否有毒性及其能否激活检测基因,以进一步揭示GPA与带Ⅲ蛋白的相互关系.材料与方法:培养红白血病细胞(K562)直到细胞总数达到109以上,收获细胞,用于粗提核内容物的制备.收集增殖状态K562细胞10 mL,提取总RNA以oligo(dT)为引物反转录合成cDNA.参照GPA GENBANK数据库中检索到的序列设计引物,PCR扩增GPA cDNA.PCR产物纯化后,进行补平,平端连接于PUC19质粒上.将经过阳性选择的重组质粒纯化、测序.双酶切PUC19-GPA,产物电泳纯化后加入经相同过程双酶切的PGBKT7,连接产物转化E.coli DH5α.在含卡那霉素平板上筛选阳性重组子,小量提纯质粒,酶切,PCR鉴定.用醋酸锂法将PGBKT7-GPA转染酵母菌,进行细胞计数,计算转染效率,以观察GPA对酵母细胞蛋白表达的影响.结果与讨论:血型糖蛋白A对维持红细胞膜表面负电荷恒定、防止红细胞凝集有重要作用.近年研究表明GPA和红细胞膜上另一种跨膜蛋白--带Ⅲ蛋白在结构与功能上有相关性.酵母双杂交系统是近年发展起来的一种研究蛋白质之间相互作用的体系.该系统不仅可以研究两个已知蛋白的相互作用,而且可以通过构建诱饵蛋白基因从基因文库中筛选出未知基因.本研究采用RT-PCR方法从K562细胞中克隆出GPA的cDNA,重组酵母双杂交系统靶基因载体,构建成pGBKT7-GPA,并转染酵母菌AH109,经检测其对酵母细胞无毒性且不能激活检测基因.因此,pGBKT7-GPA可以作为酵母双杂交系统靶基因.选用RT-PCR技术,从K562细胞中克隆到GPA基因,为国内首次报道.我们曾在国内外首次报道一种新活性的蛋白酶.该酶的活性与带Ⅲ蛋白及GPA-C结构域有关.上述研究结果为进一步研究GPA与带Ⅲ蛋白相互关系打下良好基础.
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急性缺血缺氧大鼠肠上皮细胞线粒体ATPase6基因的表达研究
目的:研究急性缺血缺氧大鼠线粒体ATPase6基因表达的变化,探讨急性缺血缺氧引起肠上皮细胞线粒体损害的分子机制.方法:(1)动物模型:通过失血性休克大鼠造成急性缺血缺氧模型.Wistar大鼠随机分成正常对照组与失血性休克组.按Wigger法放血至平均动脉压5.33 kPa,维持低血压2 h,造成急性缺血缺氧,分别于失血性休克后2 h、3 h、5 h 活杀动物.(2) 肠线粒体ATPase6基因表达测定:活杀动物后取回肠5 cm,制备肠上皮细胞悬液 ,并将细胞数调至1×109/L,用异腈酸胍盐酸盐法提取细胞总RNA.紫外测定RNA纯度和含量,并进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以鉴定其完整性.RT-PCR法使用宝灵曼试剂盒.上游引物:5' -AAACGAATAACCCTTGAGAATC-3' ,下游引物:5' -TGGTGGGTCATTATGTGTTATC-3', 特异扩增715 bp大鼠线粒体ATPase6cDNA片段.(β-actin作对照).PCR反应体系为50 μL ,包括10 μL cDNA,2 μL上游引物,2 μL下游引物,5 μL 10 ×Taq酶 buffer,4 μL dNTP,3.6 μL MgCl2,22 μL DEPC水.扩增条件:95℃变性40 s,55℃退火30 s ,72℃延伸36 s,30个循环后,再在72℃下延伸9 min.扩增产物行电泳照像分析.PCR 产物为715 bp.结果:大鼠肠线粒体ATPase6mRNA在急性缺血缺氧后2 h 表达显著减少,并随休克加重而加重.讨论:能量代谢降低是线粒体损伤的重要指标.线粒体重要功能是氧化磷酸化,即底物被呼吸酶氧化,并与之相偶联的磷酸化酶系统从而释放ATP,推动细胞的各种生命活动.ATPas e6基因是编码ATP合成的F1F0-ATPase复合物的一部分,因此,研究ATPase6基因改变在能量代谢的改变中是十分重要.我们的研究发现:失血性休克晚期,ATPase6基因表达减弱,与在失血性休克缺血缺氧时F1F0-ATPase早期升高,晚期降低,质子转运下降,ATP缺乏是一致的.我们在失血性休克肠上皮细胞线粒体DNA ATPase6基因测序研究中发现缺血缺氧时存在硷基突变及编码氨基酸的改变,进而影响F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成.故失血性休克后,如何保护线粒体功能,尽早改善缺血缺氧是救治的关键.结论:失血性休克后线粒体ATPase6基因表达在肠道损害中起一定作用,其产生与休克后急性缺血缺氧有关.
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛与外膜基因融合DNA疫苗载体的构建
目的:为增强问号赖型钩端螺旋体(017株钩体)内鞭毛抗原(flaB)与外膜抗原(ompL1)的免疫保护作用,克服保护性免疫持续时间短的难题,应用DNA重组技术以pcDNA 3.1为载体构建-表达flaB与ompL1基因的融合DNA疫苗载体,以期注入肌体后能延长保护期,激发机体长期免疫.在pcDNA3.1载体上,ompL1与flaB前后相连,前者较后者先获得递呈,与钩体天然递呈过程相似,并且双嵌合基因可诱导机体产生针对2个不同抗原表位的抗体,从而增加免疫应答能力.pcDNA3.1载体能表达融合蛋白,并且具有CpG motifs,因而可发挥佐剂作用.方法:提取017株钩体基因组DNA,参照钩体特有的高度保守的flaB与ompL1序列,设计二对四条引物:P1、P2、P3、P4.flaB与ompL1已被证实是两个良好的钩体疫苗候选抗原.通过聚合酶链反应(PCR),P1、P2引物扩增017株钩体的ompL1抗原基因;P3、P4引物扩增钩体的flaB抗原基因,分别经双酶切,以pcDNA3.1载体,将ompL1与flaB顺次同时定向嵌入同一pcDNA3.1中,获得重组质粒(ompL1与flaB),并将其转入JM109宿主菌中.在设计引物时,分别在P2、P3引物中,采用多个结构简单又不易形成折叠的甘氨酸作为接头,以维持其空间构象,不影响自然折叠,保持天然活性.结果:经酶切鉴定证实:有一1.8 kb片段插入载体,进一步经酶切证实这一1.8 kb可被酶切为9.6 kb及8.5 kb的片段,与预期的片段大小一致.以嵌合重组质粒DNA为模板,经PCR证实:P1、P2引物扩增出9.6 kb片段;P3,P4引物扩增出一8.5 kb片段.重组质粒经DNA序列检测,其中ompL1与flaB序列与文献报道的完全一致.结论:表达017钩体flaB与ompL1抗原的融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功,从而为下一步表达复合功能蛋白,进行钩体免疫保护性研究打下了基础.
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呼吸道感染样本中IFITMs引物优化
目的 优化干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced transmenmbrane proteins,IFITMs)的五个亚型基因,即IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10.方法 提取呼吸道感染样本中核酸,通过RT-qPCR筛选出具有特异性的引物且Ct值在[15,35]之间,再利用琼脂糖凝胶电泳对引物的特异性进行近一步的验证.结果 RT-qPCR结果显示IFITM1相关引物中IFITM1-3具有特异性;IFITM2相关引物中IFITM 2-2具有特异性;IFITM3相关引物IFITM3-2有较好特异性;IFITM5相关引物中IFITM5-4具有特异性;IFITM10相关引物中IFITM10-1、IFITM10-2、IFITM10-3具有特异性.具有特异性的所有引物的琼脂糖凝胶电泳条带单一明亮.结论 IFITM1-3优于该基因的其它引物;IFITM2-2优于IFITM2-1;IFITM3-2优于IFITM3-1;IFITM10-1、IFITM10-2和IFITM10-3均适用.
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内蒙古地区首例Wilson病ATP7B基因突变类型研究
患者男,19岁,因多动、站立不稳等姿势和步态异常3个月来内蒙古医科大学附属医院神经内科门诊治疗,经头部 MRI、腹部彩超、铜蓝蛋白以及K-F环的相关检查,证实患者合并有基底节、脑干、肝脏、脾脏、角膜及血液系统的多系统损害;无家族遗传史,参照《实用儿科学》关于威尔逊氏病(Wilson′s disease, WD)诊断标准综合判断为疑似 WD。取外周静脉血400μL (2%EDTA 抗凝),按照血液基因组DNA 提取试剂盒(天根公司)说明抽提基因组DNA。取无遗传家族史的体检健康者的外周静脉血为正常对照。经0.8%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计定量。根据文献合成ATP7B 基因第8外显子的相应 PCR 扩增引物:ATP7B-E8-F:5’-AACCCTTCACTGTCC TTGTC-3’;ATP7B-E8-R:5’-AGGCAGC TCTTTTCTGAAC-3’。第12外显子的PCR 扩增引物:5’-CTTGTGGTGTTT TATTTCTTC-3’;5’-ACCACCATATAGC CCAAG-3’。
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3种PCR产物纯化方法的比较
PCR产物中一般都含有过量的引物及核苷酸,这些成分将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要去除.目前核酸的纯化方法很多,但往往因需时较长或回收率太低而影响下一步的操作.近年来,商品化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变为简便快捷,但因价格高昂而令多数实验室难以承受.本研究选择3种具有代表性的常用方法对HLA-DQA1基因第二外显子的PCR产物进行纯化比较,现报道如下.
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RAPD技术分析嗜人按蚊种型方法的建立
目的建立用RAPD-PCR技术鉴别中国不同纬度地区嗜人按蚊,特别是海南岛嗜人按蚊与大陆嗜人按蚊间有无种型差异的新方法.方法收集海南、四川、江苏三地嗜人按蚊标本并传代培养,优化蚊基因组DNA的提取纯化及RAPD-PCR扩增和产物检测的条件,筛选5条TAPD引物.结果筛选出1条适合三地嗜人按蚊的引物并制定出了稳定的RAPD图谱,建立了RAPD-PCR分析嗜人按蚊种型的方法.结论不同纬度三地嗜人按蚊大部分谱带是相同的,但它们的谱带数不一定相同,且少数谱带是完全不同的.初步表明我国嗜人按蚊存在一定的种型差异,从而为解释海南嗜人按蚊在生态习性和传疟作用方面为何与大陆嗜人按蚊不同从分子水平提供了一定的科学依据.
关键词: 随机扩增的多态性DNA聚合酶链反应 嗜人按蚊 引物 种型 -
肝癌患者腹水K-ras和p53基因测序的研究
我们对32例临床确诊肝癌并腹水的标本进行K-ras基因外显子1、2和p53基因外显子5、6、7、8测序分析。1. 材料与方法:(1)标本:32例腹水患者均经确诊为肝癌,男19例,年龄31~68岁,女13例,年龄33~59岁。非癌性腹水27例,男16例,年龄23~67岁,女11例,年龄27~65岁。两组患者均无癌家族史及长期汹酒史。(2)材料:310型测序仪、2400型PCR仪由美国PE公司产,引物由上海生工生物工程公司合成,测序试剂盒、序列胶等由美国PE公司产。(3)方法:引物序列:5′GTACTGGTGGAGT ATTTGATAGTG3′,5′AAGAATGGT CCTGCACCAGTAATA3′,5′AGGTG CACTGTAATAATCCAGACTGTG3′,5′GCACTATAATTACTCCTTAATGT CAGC3′,5′GCAGTTCCTCTTCCTGCA GTACTC3′,5′AACCAGACCTCAGGC GGCTCATAG3′,5′TGTTGTCTCCT AGGTTGGCTCTGACTA3′,5′GTCC TGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGC3′。腹穿留新鲜腹水10ml,离心收集细胞沉淀,用蛋白酶K消化,苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,取基因组1μg的DNA分别扩增K-ras外显子1、2和p53基因外显子5、6、7、8,用双链产物为模板直接测序。2. 结果:32例肝癌腹水中见K-ras基因突变2例,p53基因突变9例,阳性率分别为6.25%和28.13%,其中有2例先在腹水中发现p53基因突变,后发现肝癌,见表1。
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乙型肝炎DNA疫苗系列质粒的构建及其在SP2/0细胞中的表达
近年来兴起的核酸疫苗对某些病毒感染同时具有预防和治疗作用。我们构建了一系列能表达乙型肝炎病毒大、中、小蛋白的疫苗质粒,并研究了其在SP2/0细胞中的表达情况。一、材料与方法1. S、MS、LS蛋白编码基因片段的获取:以含有adr亚型HBV全基因组pBHB4质粒为模板,用3对人工合成的引物SF/SR、S2F/SR、S1F/SR分别扩增编码小蛋白S(nt28-708)、中蛋白MS(nt3077-708)和大蛋白LS(nt2719-708)的DNA片段。引物SF、S2F和S1F分别互补于S、前S2和前S1基因起始区域,SR则互补于S基因相应的终止区。2. S1S重组基因片段的获取:采用重叠扩增PCR法对S1S2S基因进行剪切和重组,即获得不含S2的S1S重组基因片段。3. 重组质粒的构建及鉴定:将上述获得的S、S1S、S2S及S1S2S基因片段分别插入质粒pSG5UTPL/Flag载体的SV40启动子下游和质粒pRc/CMV载体的CMV启动子下游。将以上8个重组质粒转化大肠杆菌XL Blue 1,经菌落PCR鉴定技术筛选含相应插入片段的阳性克隆,然后抽提、扩增、纯化并酶切鉴定,以373A型核酸自动分析仪测定所插入片段的核酸序列。4. 重组质粒在SP2/0细胞中的表达:将纯化的质粒转染SP2/0细胞并筛选、建立长期转染细胞株。分别收集部分转染细胞,超声破碎后收集上清液,以Western-Blot检测相应蛋白质在SP2/0细胞中的表达情况。
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HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达
1. 材料与方法:乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV,长约4.5kb,带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1:1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′,XI2:1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721,由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段,在T4 DNA连接酶作用下,与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列,选用XI2、T7作为引物,PCR出现1.7kb阳性条带为反接,并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640(pH7.4)培养基中培养至60h后,用总RNA抽提试剂(Trizol Reagent)提取转染的SMMC-7721细胞,依次获得总RNA、DNA。
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一种PCR结合DNA回收克隆基因方法
目的 探讨一种结合DNA片段回收扩增目的片段的方法.方法 以PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子为例,根据GenBank报道的序列设计引物,PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子.结果 PCR产物有非特异DNA片段、根据DNA片段大小采取凝胶DNA回收与预期片段相符的DNA片段,送公司测序.测序结果表明所扩增的序列和GenBank报道的序列一致.结论 用该方法可以成功克隆出目的DNA片段.