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数字PCR技术及其应用进展
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数.相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广.本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述.
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HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706的特性分析
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的威胁人类健康的重要传染病,迄今尚无有效的疫苗及特异性抗病毒治疗药物.抗HCV药物的研究和开发面临的关键问题是缺乏合适的HCV感染细胞及动物评价模型.转基因细胞模型是研究人类疾病常用的有效手段,因此,在HCV分子生物学进展的基础上,我们以对HCV翻译与复制有明显调控功能的HCV 5′NCR及部分翻译起始区序列为靶标,构建了HCV 5′NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因的融合基因,插入真核表达载体,转染HepG2细胞,获得了HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706细胞株[1].本文对该细胞的某些特性进行了分析,以便更好地利用该细胞模型进行药物评价.
关键词: HepG2.9706细胞株 荧光定量PCR Southern杂交 拷贝数 荧光素 -
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂实验室性能评估要求解析
肿瘤的发生是一种多因素作用、多基因参与、多信号通路激活的复杂生物学过程[1]。当前主要影响肿瘤药物治疗效果的因素在于肿瘤的个体化差异,对于不同的个体,癌细胞的侵袭性明显不同,个体对药物的反应性亦有显著差别。随着肿瘤分子生物学和人类基因组学的研究进展,人们发现肿瘤从根本上说是一种基因性疾病,肿瘤的形成、转移及耐药性等均与肿瘤相关基因(tumor-related gene)的突变有关,这里所述的基因突变包括基因易位、重排、缺失、插入、拷贝数异常及核糖核酸(RNA)表达异常等[2]。
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乳腺癌中比较基因组杂交研究的进展
近年来,随着比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)技术在研究肿瘤相关染色体异常方面的应用[1],已发现乳腺癌发生、发展不同时期存在非随机性染色体基因组DNA拷贝数改变,而不同类型的肿瘤在基因组异常方面又存在很大的异质性[2];利用芯片-CGH技术的高分辨率还能鉴别肿瘤的不同亚型[3].
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人鼻型NK/T细胞淋巴瘤表达谱基因芯片的筛查研究
Ko等[1]对7例鼻型NK/T细胞淋巴瘤进行了比较基因组杂交和杂合性缺失分析,发现在染色体2q、3q、5q、10q、13q、17q和21q等处有DNA拷贝数增加;而在1p、17p、6q、12q和13q有基因缺失.Oka等[2]对NK/T细胞淋巴瘤细胞系NK-YS作了初步的基因芯片检测,发现蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶SHP-1基因表达下调.本研究旨在初步筛选和观察部分肿瘤相关基因差异性表达的情况.
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循环引物介导原位标记技术在结直肠癌检测中的应用
引物介导的原位DNA标记(PRINS)是分子生物学领域近年来发展的一项新技术,具有方便、特异性强、敏感性高的优点[1-4].然而,我们在实验中发现单纯的PRINS技术对检测样本拷贝数有着较高的要求,尤其是石蜡切片中mRNA拷贝数量很低,阳性信号表达较弱.为提高检测效果,我们采用PRINS与PCR技术相结合的新方法--循环引物介导的原位标记(cycling-PRINS,C-PRINS),生物素连接辣根过氧化物酶标记,DAB显色法,以提高石蜡切片检测mRNA表达的敏感性.
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丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏 IRS-1的调节作用
目的::观察彩色蚕茧水提物-丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素受体底物-1( IRS-1)的调节作用。方法:48只雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组、糖尿病模型组、丝胶治疗高剂量组和丝胶治疗低剂量组,每组12只大鼠。采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法制作2型糖尿病大鼠模型,以空腹血糖≥11.1mmol/L作为成模标准。待模型成功建立后,丝胶治疗高(2.4g/kg/d)、低(1.8g/kg/d)剂量组大鼠分别给予不同剂量丝胶灌胃35天,正常对照组、模型组大鼠给予同等剂量生理盐水灌胃35天。釆用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠的血糖,采用Real Time PCR法检测各组大鼠肝脏IRS-1 mRNA的表达。结果:模型组大鼠的血糖为(29.45±4.82)mmol/L,明显高于正常对照组大鼠的血糖(10.83±2.03) mmol/L(P<0.05);丝胶治疗高、低剂量组大鼠的血糖分别为(13.20±4.09)mmol/L、(13.18±2.30)mmol/L,均明显低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠肝脏IRS-1 mRNA的表达水平为(0.0099±0.0040)拷贝数/μl,明显低于正常对照组大鼠(0.0251±0.0041)拷贝数/μl(P<0.05);丝胶治疗高、低剂量组大鼠肝脏的IRS-1 mRNA的表达水平分别为(0.0108±0.0039)拷贝数/μl、(0.0131±0.0036)拷贝数/微升,均明显高于模型组( P<0.05)。结论:IRS-1是胰岛素PI3 K/Akt信号通路的关键因子,本研究提示丝胶可能通过提高PI3 K/Akt信号通路IRS-1的表达发挥降低血糖的作用。
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DNA拷贝数变异及其研究进展
人类基因组变异有多种形式,例如单核苷酸多态性(SNPs)、可变数串联重复序列、转座因子的有无以及结构变异。在基因组中这些变异普遍存在并且广泛分布,个体间表型差异和许多遗传病及一些疾病的易感性被认为是由这些变异造成的。
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慢性丙型肝炎的细胞凋亡调节蛋白、白细胞分化抗原54和白介素18的水平及意义
丙型肝炎易演变为慢性或发展为肝硬化或肝癌,其发病机制主要为免疫病理损害.我们对可溶性细胞凋亡调节蛋白(sFas)、白细胞分化抗原54(sCD54)、白介素18(IL-18)在慢性丙型肝炎致病过程中的作用进行了探讨,并分析其与血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性和丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)拷贝数的关系及抗病毒治疗疗效考核中的意义.
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微阵列比较基因组杂交技术及其在遗传性疾病中的应用
拷贝数变化(copy number alterations,CNVs)是指患者与健康对照之间基因组DNA拷贝数的差异,以及导致微缺失或微复制综合征的基因组不平衡,如缺失、重复、扩增和非整倍体等.基因组CNVs通过基因缺失(或)重复、基因断裂、位置效应、后生效应或上位效应等方式可导致各种人类疾病或功能障碍.近研究发现,CNVs是许多遗传病的细胞遗传基础,根据特征性的CNVs,可对遗传病进行准确诊断.
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HIV-1病毒载量测定技术的新进展
HIV-1病毒载量是指机体内游离病毒的含量.它是一个计数单位,表示每毫升血浆中含多少拷贝数的HIV-1RNA,是反映HIV-1患者疾病进展的关键指标之一[1].通过对HIV-1病毒载量的测定,不仅可以帮助判断HIV-1感染者的状况,还可以用于判断抗病毒治疗的效果,当患者出现耐药性时,也能很快地给出结果从而指导治疗的优化[2].相对于CD4的测定,病毒载量的测定能够提供较早的参考信息.
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胃癌线粒体DNA拷贝量的变化
目的:通过比较线粒体基因组(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数在胃癌和癌旁胃黏膜组织间的差异,阐述mtDNA与胃癌发生的关系.方法:PCR分别扩增胃癌组织和癌旁胃黏膜组织各20例共40个样本的线粒体D-1oop两个高变区HV1(hypervariable region)和HV2;并以核基因组的β-actin作为定量标准物.聚丙烯酰胺凝胶电泳(po1yacrylamide ge1 electrophoresis,PAGE)银染比较mtDNA拷贝数在癌和正常组织间的差异.结果:HV1和HV2拷贝量(用β-actin标准化)在胃癌组织和癌旁组织间有显著的差异(P<0.01);其拷贝量与组织类型,癌组织浸润深度未发现有统计学联系(P>.05);而与核内一些重要的酶:碱性磷酸酶(AKP)、环腺苷酸磷酸二脂酶(cAMP-PDE)和环鸟苷酸磷酸二脂酶(cGMP-PDE)表达有一定关系(P<.05).结论:胃癌的发生与胃上皮细胞内mtDNA量的减少有着密切的关系.有望成为一种新的肿瘤分子标志物.
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线粒体DNA拷贝数与疾病
线粒体是人体中的重要细胞器,参与生物体的新陈代谢,线粒体DNA(mtDNA)拷贝数更是与糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等多种疾病密切相关.mtDNA突变常常导致多器官功能障碍,从而产生一系列的临床综合征.本文回顾近年来有关mtDNA拷贝数的文献,对mtDNA拷贝数及其调控机制、以及mtDNA与临床疾病的相关性等方面进行阐述.
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结直肠癌线粒体DNA拷贝数与其微卫星不稳定关系的研究
目的 探讨结直肠癌(CRC)的线粒体DNA(mtDNA)拷贝数异常与临床指标及微卫星不稳定(MSI)的关系.方法 选取50例CRC及相应癌旁组织标本,分别提取基因组DNA.对非编码区微卫星位点进行测序;对线粒体ND1基因进行荧光定量PCR,进而计算出mtDNA拷贝数;然后与临床指标和非编码区MSI进行比较分析.结果 CRC组织的mtDNA平均拷贝数/细胞数为312±185,而相应的癌旁组织为525±125,前者显著低于后者(P<0.001).mtDNA拷贝数高低与非编码区MSI有明显相关性(P<0.001),与性别、年龄、病理分型、TNM分期无相关性(P>0.05).结论 CRC的mtDNA拷贝数明显降低,这种降低与线粒体的MSI相关.
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多重连接依赖性探针扩增技术及其在临床中的应用
多重连接依赖性探针扩增(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification,MLPA)技术是一种高效、特异、快速、简便,针对待检核苷酸序列进行定性和相对定量分析的技术.2002年Schouten等[1]在多重扩增探针杂交(Multiplex amplifiable probe hybridisation,MAPH)技术基础上进行改进而建立了MLPA技术.该技术在一次性反应中可检测45个核苷酸序列拷贝数的改变,目前已广泛应用于染色体数目异常、基因缺失/重复、DNA甲基化检测等多个分子生物学诊断领域.
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芯片技术及其在医学遗传染色体异常诊疗中的应用指南
1 简介随着比较基因组杂交芯片以及单核苷酸多样性微阵列分析等微阵列技术在临床上的应用,实验室对于患者在发育迟缓/智力障碍(DD/ID)、先天畸形以及异形的评价体系在近几年产生了很大的变化.患者基因组中无法用经典G显带方法检测的小缺失和小重复,现在都能用这些方法检测到.由于这些年全基因组拷贝数微阵列技术在临床应用的日渐广泛,我们在这里对相关指南进行更新.
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TUPLE1基因缺失和微卫星核心序列拷贝数变化与先天性心脏病发病的关系
新生儿先天性心脏病( congenital heart disease , CHD)的发生率为活产儿的1%,孕中期B超检出率为0.47%[1]。许争峰等[2]报道的163例CHD患儿中,发生22号染色体长臂近着丝粒端微片段22q11.21~q11.23缺失(22q11微缺失综合征)者为7.36%;其中22q11微缺失综合征在活产儿中发生率为1/4000[3],10%~15%有家族史。常见22q11的缺失片段定位于D22S427/1638和D22S306/308之间的区域,大小为1.5~3 Mb,这段区域内包含30多个基因。而8%的CHD患儿有1.5 Mb的小缺失,这段区域内含有24个基因,其中包括TUPLE1、TBX1、COMT等热点基因[4],有学者认为,缺失片段的大小会影响CHD患儿的临床表型[5]。毕竟22q11微缺失的表型广泛多样,因此,22q11.2微缺失的临床表型与基因型之间可能存在某些内在的联系。本研究对CHD患儿染色体22q11.2区域内的5个短串联重复(short tandem repeat,STR)位点(包括D22S1638、D22S941、D22S944、D22S264、D22S873)进行检测,旨在探讨 TUPLE1基因缺失及其周围微卫星核心序列变化导致CHD患儿发病的可能机制。
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应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测子宫颈人乳头状瘤病毒16、18型
人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌的发生有密切关系.与生殖道病变有关的HPV的亚型有近30种,可分为低危型和高危型,高危型HPV主要为HPV 16、18型.我们应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术[1,2],检测不同宫颈病变组织HPV 16、18型DNA拷贝数量,以建立快速、准确地检测HPV16、18型DNA的方法.
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产前诊断中常见染色体异常的快速检测与核型分析技术的应用
常见的胎儿染色体异常多发生于21、18、13号常染色体和性染色体X、Y.染色体数目异常或拷贝数的改变,包括21三体(唐氏综合征)、18三体(Edwards综合征)、13三体(Patau综合征)、45,X(特纳综合征)、47,XXY(Klinefelter综合征)和三倍体,约占产前诊断中有临床意义的染色体异常的80%.
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染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用
染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis,CMA)技术是一种高分辨率、高通量检测人类基因组DNA拷贝数变异(copy number variant,CNV)的分子核型分析技术。CNV是指长度≥1 kb的DNA片段[1],约15%的人类遗传病由基因组CNV引起[2]。近年来,CMA技术在产前诊断领域中的应用越来越广泛,很多研究证明了该技术具有传统染色体核型分析所无法比拟的优势。CMA技术对染色体非整倍体和不平衡染色体重组的检出率与传统染色体核型分析相同,且分辨率和敏感度更高。更为重要的是,CMA技术能检出染色体核型分析技术检测不到的基因组微缺失或微重复变异。