首页 > 文献资料
-
骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的初步研究
目的 建立成人骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养和扩增的方法,探讨其生物学特性,建立稳定的MSCs体外培养扩增体系.方法 取正常成人骨髓5 ml,用Percoll分离液(密度1.073 g/ml)经密度梯度离心法分离得到单个核细胞,以2×105个细胞/cm2的密度接种于含10%新生牛血清的LG-DMEM培养液.经培养、扩增后,应用倒置相差显微镜观察其形态,MTT法测定生长曲线.流式细胞仪行细胞表面抗原及细胞周期的检测,并在透射电镜下观察其超微结构.结果 培养扩增获取的成人骨髓MSCs形态均一,为梭彤或纺锤形的成纤维细胞样外观,生长曲线示其增殖能力强.流式细胞仪检测显示有90%以上的细胞处于GO/G1期,表面标记物中CD44表达阳性,而造血细胞表面标志CD3、CD4、CD7、CD13、CD14、CD15、CD19、CD22、CD33、CD34、CD45和与移植排斥发生密切相关的HLA-DR表达阴性.超微结构显示细胞内有丰富的粗面内质网,细胞器发达.结论 所建立的分离和培养方法可获取骨髓粘附细胞中一组独特的细胞群,具有MSCs的生物学特性,可作为组织工程中的种子细胞.
-
Ca2+在电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化过程中的内流变化
背景:已证实电磁场可通过cAMP-蛋白激酶A信号转导系统调控骨髓间充质于细胞的增殖与分化.但同样作为第二信使的Ca2+相关作用报道较少.目的:观察钙拮抗剂维拉帕米对电磁场刺激骨髓间充质干细胞增殖与分化的影响,以推断Ca2+在此过程中的内流变化.设计、时问及地点:电刺激细胞学体外观察,于2005-04/06在同济医院矫形外科实验室完成.材料:清洁级4～5周龄SD大鼠6只,维拉帕米为Sigma公司产品,Helmholtz线圈式磁场发生器由海军工程大学电机系设计制造.方法:贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化传代.取生长良好的第4代细胞,调节密度至1×107L-1,将其分种于4块96孔板内,200μL/孔.正常对照组不进行任何干预:暴磁组接种第2天将细胞放于置有Helmholtz线圈式磁场发生器的37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度细胞培养箱中进行暴磁,磁场强度0.8 mT,频率50Hz,每次暴磁30min,间隔12h,共6次;维拉帕米组加入20 μ mol/L维拉帕米;联合组加入20 μ mol/L维拉帕米后进行暴磁.主要观察指标:MTT法检测细胞增殖活性,向成骨细胞分化碱性磷酸酶的含量,改良Gomori氏钙钻法染色定性观察.结果:暴磁3 d后,与正常对照组比较,暴磁组细胞增殖活性明显升高(P<0.01),加入维拉帕米进行药物干预后这种促细胞增殖效应消失.未经暴磁的正常对照组、维拉帕米组细胞碱性磷酸酶含量基本相似,均明显高于其余2组(P<0.01);联合组细胞碱性磷酸酶含量高于暴磁组(P<0.01).碱性磷酸酶染色定性分析结果与上述数据基本一致.结论:在50Hz、0.8 mT电磁场作用下,骨髓间充质干细胞Ca2+内流发生变化,且该变化在骨髓间充质干细胞向成骨方向分化过程中产生部分抑制作用,在促其增殖过程中起主导作用.
-
猪小肠黏膜下层支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程骨膜对T淋巴细胞增殖的影响
背景:小肠黏膜下层为无细胞胶原层.含有多种生长因子,主要由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成,与骨膜相似.目的;观察猪小肠黏膜下层支架构建兔组织工程骨膜对兔外周血T淋巴细胞增殖的影响,探讨兔组织工程骨膜的免疫学特性.设计、时间及地点:体外细胞学对比观察,于2005-09/2007-03在兰州大学附属第二医院骨科研究所完成.材料:健康家猪小肠,出生20 d的新西兰纯种兔4只.方法:采用沉淀法以猪小肠黏膜下层作为支架材料,复合培养兔骨髓间充质干细胞成骨诱导细胞构建兔组织工程骨膜.分离兔外周血T淋巴细胞作为单向混合淋巴细胞反应中的效应细胞.实验分3个刺激组:成骨诱导细胞组(间充质干细胞成骨诱导14 d)、组织工程骨膜组(间充质干细胞成骨诱导14 d复合小肠黏膜下层支架)、单纯小肠黏膜下层组(单纯小肠黏膜下层支架),分别加入单相混合淋巴细胞反应液中.主要观察指标:MTT法体外检测各组对外周血T淋巴细胞增殖水平的影响.结果:成骨诱导细胞组、组织工程骨膜组、单纯小肠黏膜下层组的淋巴细胞增殖抑制率分别为(11±3)%,(23±5)%,(48±10)%.成骨诱导细胞组和组织工程骨膜组淋巴细胞增殖抑制率低于单纯小肠黏膜下层组,差异有显著性意义(P<0.01),成骨诱导细胞组与兔组织工程骨膜组比较差异无显著性意义(P>0.05).结论:构建的组织工程骨膜可抑制兔外周血T淋巴细胞增殖,组织工程骨膜与单纯间充质干细胞成骨诱导细胞同样具有调节免疫作用.
-
模拟微重力培养骨髓间充质干细胞定向诱导复合改良纤维蛋白原支架修复兔关节软骨缺损
背景:模拟微重力培养系统通过模拟细胞生存的体内微重力环境,使细胞承受较低的剪切力, 提高细胞内外、细胞间物质传递效率,从而提高细胞分化质量.目的:观察微重力培养环境在构建组织工程模块修复关节软骨缺损中的作用.设计,时间及地点:体外实验采用自身对照;体内实验采用随机分组比较,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室及南方医院动物实验中心进行.材料:3周普通级龄新西兰兔1只用于骨髓间充质干细胞培养;3月龄新西兰兔48只用于体内验证实验.方法:以纤维蛋白胶粉、凝血酶、氯化钙、抑肽酶、氨甲环酸制备纤维蛋白原支架.体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞3周,使之吸附于改良纤维蛋白原支架上在微重力环境下三维立体培养3周.48只兔做软骨钻孔制备软骨缺损动物模型,每只兔4孔.实验分为4组,每组48孔,微重力培养组在孔内植入微重力培养下的软骨细胞组织模块;普通培养组在孔内植入普通培养下的软骨细胞组织模块;单纯支架组在孔内植入空白支架;空白组孔内不植入任何材料,分别于2,6,12周处死动物,取相应标本.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学检测微重力培养环境在三维立体培养对软骨细胞增殖及功能的影响,以及用组织工程学评分检测微重力环境下培养的软骨模块对缺损的修复效果.结果:模拟微重力培养条件下构建的模块体外培养3周,细胞数量明显增多,并分泌较多的细胞基质,包裹在软骨细胞周围.组织工程学评分显示微重力培养组修复软骨缺损的效果明显好于其他组.结论:模拟微重力培养环境对三维立体培养软骨细胞模块有比较良好的效果.
-
不同来源血清体外培养骨髓间充质干细胞的研究
目的 适当的血清浓度可维持骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养,而不同来源的血清对BMSCs的培养效果是否小同.本研究探讨自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清在体外培养人BMSCs的可行性.方法 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入白体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清,观察比较细胞形态、表面抗原、生长曲线及各组在诱导剂作用下表面抗原和诱导分化的相关性.结果 从BMSCs的形态学、生长曲线、表面抗原、诱导分化上看各组无明显差异,生长状况良好.结论 自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清均可维持BMSCs的体外培养,而自体血清解决异种和异体血清带来的一些潜在的风险,更为安全.
-
合成成骨生长肽对人骨髓间充质干细胞的促成骨作用
目的 研究合成成骨生长肽(Sogp)对人骨髓问充质干细胞(BMSCs)分化的影响.方法 分离BMSCs进行体外培养,加入不同浓度的Sogp,观察细胞形态变化,RT-PCR法检测3种主要成骨标志物[碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原、骨钙素]的表达,组织化学染色检测ALP、Ⅰ型胶原的表达及钙质的沉积并进行图像分析.结果 Sogp在tuRNA和蛋白水平均能促进各成骨标志物的表达,定量分析结果 显示,Sogp在10-9mol/L浓度组促成骨的作用强.结论 Sogp能促进入BMSCs向成骨方向转化.这种促成骨能力与其浓度密切相关,以10-9mol/L浓度促成骨能力强.
-
体外"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化
目的 探讨在体外"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导能否促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化.方法 (1)分离、纯化大鼠BMSCs,分组后用5-Aza诱导部分BMSCs.(2)BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养.(3)免疫荧光法鉴定BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI).结果 免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组与未诱导组比较MHC、cTnI阳性率显著增加,且5-Aza双次诱导组较单次诱导组MHC、cTnl阳性率显著增加.结论 (1)体外"心肌样"环境下5-Aza能够促进BMSCs向心肌样细胞分化.(2)5-Aza双次诱导较单次诱导效果更好.
-
Cad-Ⅱ基因转染的兔骨髓间充质干细胞自体移植术后的表达研究
[目的] 研究Cad-Ⅱ基因转染的骨髓间充质干细胞在骨缺损局部移植后Cad-Ⅱ基因的表达变化.[方法] 20只日本长耳白兔制作双侧髂骨缺损模型,将体外培养扩增的自体骨髓干细胞经脂质体介导转染Cad-Ⅱ基因,再与胶原海绵复合移植于髂骨缺损处,术后4周取材,RT-PCR和免疫组化方法检测Cad-Ⅱ基因的表达.[结果] 术后4周各组骨缺损区已有新骨生成,Cad-Ⅱ基因转染移植组和对照组均检测到Cad-ⅡmRNA的表达,但转染组Cad-Ⅱ mRNA的表达显著高于对照组(P＜0.01).免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较转染移植各组Cad-Ⅱ阳性细胞数量也显著增多(P＜0.01).[结论] 转染了 Cad-Ⅱ基因的骨髓间充质干细胞使骨缺损区Cad-Ⅱ基因的表达增高.
-
骨髓间充质干细胞移植治疗跟腱炎
骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,我们通过研究建立跟腱炎动物模型,收集兔骨髓问充质干细胞,并植入到动物模型体内.一、材料与方法1.材料:D-Hanks液(上海捷瑞生物工程有限公司),羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒(南京建成生物工程),二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物工程有限公司),Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司).
-
小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向平滑肌样细胞分化过程中myocardin的表达
目地 探讨血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为平滑肌细胞的可行性及myoeardin在此过程中的表达变化.方法 采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞,血小板源性生长因子BB(50μg/L)联合高浓度胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞,分别于诱导前,及诱导4 d和8 d后用免疫细胞化学法检测细胞平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和mytraudin的表达.结果 免疫组织化学显示,诱导前及诱导4 d和8 d时,平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和myoeardin三种蛋白的表达逐渐增强,平均灰度值逐渐降低.不同时间点之间比较差异有显著性(P<0.05).结论 血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清可有效诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.Myocmxtin在此分化过程中可能起了重要作用.
-
猪肝细胞与骨髓间充质干细胞适共培养体系的建立
细胞/MSCS以2:1共培养组的肝细胞清蛋白分泌水平、尿素合成能力和细胞色素P450为各组中之佳,自第1天培养起均显著高于对照组(P<0.05),并在第2天达到高峰,而且下降趋势较缓慢.结论 猪肝细胞/MSCS按2:1组成的适共培养体系可大程度地维持肝细胞功能.为构建功能性生物人工肝提供高效细胞材料.
-
不同浓度羊自体血清对骨髓间充质干细胞增殖能力影响的研究
目的 观察不同浓度羊自体血清对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,bMSCs)增殖活力的影响,并筛选出佳血清培养浓度.方法 以12月龄青山羊为实验动物,首先制备自体血清,分离获取bMSCs;然后选DMEM/F12为基础培养基,采用不同体积分数(分别为5%、10%、15%)自体血清及10%体积分数胎牛血清培养基分别对bMSCs进行培养;通过显微镜下细胞形态学观察、活细胞计数及MTT等方法对细胞进行检测,并对检测数据做统计学分析.结果 不同浓度自体血清培养培养条件下bMSCs形态正常.与10%胎牛血清组进行比较,5%自体血清组bMSCs增殖较慢(P＜0.01),10%、15%自体血清组增殖较好,但组间无统计学差异(P＞0.05).结论 羊自体血清培养bMSCs是可行的,10%浓度自体血清是佳培养浓度.
-
大鼠EPO真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建表达大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的真核表达质粒pEGFP-NI/EPO,并检测其在体外的表达.方法 从大鼠肾脏获得EPO基因片段并用RT-PCR方法 扩增,将其连接于真核表达质粒pEGFP-NI,测序鉴定后,用脂质体包裹转染大鼠骨髓问充质干细胞(mesenchymal stem cels,MSCs),采用免疫组化和RT-PCR检测EPO的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染大鼠MSCs细胞后可表达EPO蛋白.结论 成功构建的pEGFP-NI/EPO重组质粒能在体外表达EPO蛋白.
-
兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的实验研究
目的动态观察体外神经营养剂联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的效果.方法将BMSCs分离体外扩增培养后,分别加入神经营养剂金路捷、三磷酸腺苷(ATP)、神经节苷脂(GM1)+bFGF诱导其分化.分别于6、24、48、72、96h后光镜下观察细胞形态变化并通过免疫组织化学测定特异性神经元稀醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果神经营养剂联合bFGF诱导6 h后出现胞体收缩,Nestin表达阳性,24 h后伸出突起,有不同程度NSE、GFAP表达,3 d后达高峰.结论神经营养剂联合bFGF能提高诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的诱导率.
-
大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞
目的:探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell,MSC) 分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性.方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达.结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征.MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12.结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞.
-
阿伦膦酸钠对去势大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
目的 探讨阿伦膦酸钠(Alendronate,Aln)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响,并阐明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在该过程中的作用. 方法 BMSCs取自9个月龄去势SD大鼠,分别暴露于0.01,0.1,1,10 μmol/L Aln.成脂诱导2周后进行油红O染色和镜下计数分析,RT-PCR检测过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(PPARγ2)表达;使用MAPK通路特异性抑制剂并诱导2周后再观察PPARγ2表达情况,Western blot观察Aln对MAPK通路表达的影响. 结果 BMSCs成脂诱导2周后,油红O染色阳性细胞数随着药物浓度的增高而显著减少(P<0.01).PPARγ2表达随着药物浓度的增高而显著降低.分别使用ERK1/2、JNK抑制剂PD98059和SP600125并诱导2周后,PPARγ2表达上调;使用p38抑制剂SB203580并诱导2周后,PPARγ2表达下调.Western blot结果显示,Aln在5,15,30 min时上调P-ERK1/2和P-JNK的表达,分别使用抑制剂后,表达下调. 结论 Aln通过激活ERK1/2和JNK信号通路,而不是p38,发挥抑制去势大鼠来源的BMSCs成脂分化作用,其效应具有浓度依赖性.
