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myocardin在低氧诱导肺血管内皮向平滑肌样细胞转分化中的作用
目的探讨低氧条件下肺动脉内皮细胞(PAEC)向平滑肌样细胞的转分化及myocardin在其转分化过程中的作用.方法经免疫磁珠法(用血小板内皮细胞黏附分子1做免疫分选标记)纯化分离的原代肺动脉内皮细胞,用RNA干扰(RNAi)技术构建psimyocardin RNA表达载体抑制myocardin基因的表达.细胞分为常氧组(含21%O2,5%CO2和74%N2)、低氧组(含1%O2,5%CO2,94%N2)、常氧+myocardin抑制组和低氧+myocardin抑制组,分别培养1 d、4 d和7 d.用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测myocardin mRNA的表达;免疫荧光检测平滑肌特异性标志物α-平滑肌(α-SM)肌动蛋白的表达,结合形态学鉴定平滑肌样细胞的转分化.结果(1)免疫荧光检测PAEC中α-SM-肌动蛋白阳性率在低氧4 d组(0.96‰±0.08‰)明显低于7 d组(2.07‰±0.06‰,P＜0.01),阳性细胞呈梭形或多角形,而常氧组和低氧1 d组均未见α-SM-肌动蛋白的阳性表达;(2)RT-PCR显示myocardin mRNA的表达在低氧4 d组(0.14±0.01)明显低于低氧7 d组(0.23±0.03,P＜0.01),常氧组和低氧1 d组均未检测出其表达.(3)RNAi沉默myocardin基因表达后,其mRNA水平明显低于对应的低氧4 d组(0.03±0.02)和低氧7 d组(0.05±0.01,P＜0.01);平滑肌样细胞的转分化率也明显降低(0.19‰±0.07‰,0.21‰±0.04‰,P＜0.01).以上每组重复3次.结论PAEC中存在少数细胞具有转分化为平滑肌样细胞的潜能,低氧可明显促进其转分化,myocardin在此转分化过程中起重要作用.
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Myocardin与核因子-κB在子宫平滑肌瘤中的表达及关系
目的 研究myocardin和核因子(NF)-κB在子宫平滑肌瘤与正常子宫肌层表达的差异,探讨二者在子宫平滑肌瘤发病中的作用机制.方法 应用免疫组织化学方法检测myocardin与NF-κB在81例子宫平滑肌瘤组织和81名正常子宫肌层组织中的表达情况.结果 与正常肌层组织相比,子宫平滑肌瘤组织中myo-cardin的表达降低(P＜0.05),NF-κB的表达增高(P＜0.05),两者表达呈相关性(P＜0.05).两者的表达与患者的年龄、肌瘤个数、有无变性无关.结论 Myocardin与NF-κB可能在子宫平滑肌瘤的发生发展过程中发挥重要作用,NF-κB可能下调myocardin蛋白表达参与子宫平滑肌瘤的发生.
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云南白药对血管平滑肌增殖基因Myocardin的影响研究
目的:研究云南白药对活性氧诱导的SM-Myocd细胞增殖的影响.方法:采用不同浓度过氧化氢(H2O2)作为外源性活性氧刺激SM-Myocd细胞增殖,应用MTT、Western blot测定等方法观察给予不同浓度云南白药干预处理,观察云南白药对H2O2作用后SM-Myocd细胞增殖的影响.结果:H2O2具有促进SM-Myocd细胞增殖的作用,其浓度为50um时增殖作用为显著(P＜0.05);云南白药能够抑制H2O2促SM-Myocd细胞的增殖作用,其浓度为10ug/ml时抑制作用为显著(P＜0.05).结论:云南白药具有减轻H2O2对SM-Myocd细胞的损伤作用,对动脉粥样硬化斑块形成、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的防治具有应用前景,可望成为新的干预靶点.
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Myocardin亲水区原核表达载体的构建
目的:针对不同种属(小鼠、大鼠、人)的myocardin序列进行比对,并通过理化性质分析,在同源区域中选择兼具备抗原性和亲水性较强的基因片段,构建重组质粒.方法:通过聚合酶链反应(PCR)以Q935为模板制备Myocardin目的 基因,通过pET22b载体线性化以及连接、转化等方法构建原核表达载体pET22b-MyocardinN,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定.结果 正确构建了原核重组表达质粒pET22b-MyocardinN,基因测序结果表明,与NCBI的小鼠Myocardin已知序列完全一致.结论 成功构建的原核重组表达载体pET22b-MyocardinN,为后续蛋白表达,制备可抗多种属Myocardin的抗体提供了基础.
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Myocardin/MRTFs家族的研究进展
血清应答因子(serum response factor,SRF)与其顺式元件CArG-box之间的相互作用对于平滑肌标志基因的转录是非常重要的.但为什么SRF这样一个普遍表达的转录因子能够选择性的激活平滑肌细胞特异性的基因转录,其机制尚不清楚.研究显示,SRF对平滑肌特异性基因表达的调节活性可受多个环节的调节,涉及SRF的表达、核转位、选择性拼接以及SRF自身的翻译后修饰等.其中令人关注的机制是Olson等人在2001年发现的一种蛋白--myocardin和myocardin相关转录因子(Myocardin-related transcription factors,MRTFs),它们通过与SRF相互作用而协同激活SRF依赖的基因转录.本文就myocardin/MRTFs家族的结构、表达模式、功能及其调节予以综述.
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雌激素/雌激素受体α信号通路抑制血管平滑肌细胞SM22α的转录作用
目的 确定雌激素/雌激素受体α(ERα)信号通路对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)分化标志基因SM22α的转录调节作用.方法 利用组织块贴壁法分离获得大鼠VSMCs,采用PCR方法扩增获得大鼠SM22α,并插入到pGL3-Basic质粒中构建SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒.分别在VSMCs和COS-7细胞中利用Luciferase检测雌二醇(E2)、ERα及Myoeardin对SM22α启动子转录活性的影响情况.结果 SM22α启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功,E2、ERα可以抑制Myocardin对SM22α的转录活性.结论 E2/ERα信号通路可通过抑制Myocardin对SM22α的转录活性,从而促进VSMCs由分化型向增殖型转变.
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Myocardin与相关疾病研究进展
心肌素( MYOCD)是心肌和平滑肌细胞( SMC)分化过程中一个强有力的转录共激活因子,这一作用是通过其与血清效应因子( serum response factor,SRF)以及目的基因顺式作用元件CArG 盒共同结合形成三元复合物而实现的。近年来研究发现,MYOCD基因表达的异常和许多疾病的发生相关,如心力衰竭、肿瘤、血管疾病,以及糖尿病等。本文就MYOCD的分子结构、表达调控及其与相关疾病的研究进展作一综述。
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锌指蛋白297B协同Myocardin调节平滑肌细胞的分化
目的 探讨锌指蛋白297B在平滑肌细胞分化过程中的表达及相关机制.方法 用定量实时多聚酶链反应检测锌指蛋白297B在人、大鼠和小鼠平滑肌细胞中体内/体外的表达量及在平滑肌细胞体内和体外分化或增殖过程中的表达变化;构建锌指蛋白297B-Myc表达质粒,免疫荧光检测锌指蛋白297B-Myc在大鼠平滑肌细胞中的表达分布;用荧光素酶活性检测及免疫共沉淀实验检测锌指蛋白297B与Myocardin的结合及相互作用.结果 锌指蛋白297B在平滑肌细胞中特异性高表达,在小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞分化过程中表达上调,在血小板源性生长因子BB刺激的平滑肌细胞增殖过程中下调,在大鼠颈动脉球囊损伤内膜修复过程中表达先上调后下降.锌指蛋白297B主要分布于细胞核及核周的细胞质.锌指蛋白297B能与Myocardin蛋白结合,荧光素酶活性检测显示锌指蛋白297B的表达受Myocardin的调控.结论 锌指蛋白297B可能在平滑肌细胞分化过程中起到重要正向调控作用,这一作用很可能是通过锌指蛋白297B与Myocardin的协同作用来完成.
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低密度脂蛋白诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的作用
目的 探讨低密度脂蛋白诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化及myocardin在其分化过程中的作用.方法 不同浓度血清培养骨髓间充质干细胞条件下加以低密度脂蛋白刺激.细胞分为常规培养组,常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L), 20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组.免疫细胞化学检测myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链的表达、RT-PCR法检测myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌钙结合相关蛋白mRNA的表达.结果 免疫细胞化学结果显示常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L),20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组分别与常规培养组比较myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链的表达增强(P<0.05);20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组与20%胎牛血清组比较上述三种蛋白表达增强(P<0.05);平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链蛋白的表达与myocardin表达呈正相关(r=0.9018,P<0.05;r=0.7969,P<0.05).RT-PCR结果显示常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L), 20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组分别与常规培养组比较myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌钙结合相关蛋白mRNA表达明显增强(P<0.05);20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组比较上述三个指标的表达也增强(P<0.05).平滑肌肌动蛋白、平滑肌钙结合相关蛋白mRNA表达与myocardin正相关(r=0.9295,P<0.05;r=0.8940,P<0.05).结论 高浓度血清,低密度脂蛋白均可诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化,低密度脂蛋白联合20%胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的作用强.myocardin可能在此过程中起重要作用.
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小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向平滑肌样细胞分化过程中myocardin的表达
目地 探讨血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为平滑肌细胞的可行性及myoeardin在此过程中的表达变化.方法 采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞,血小板源性生长因子BB(50μg/L)联合高浓度胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞,分别于诱导前,及诱导4 d和8 d后用免疫细胞化学法检测细胞平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和mytraudin的表达.结果 免疫组织化学显示,诱导前及诱导4 d和8 d时,平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和myoeardin三种蛋白的表达逐渐增强,平均灰度值逐渐降低.不同时间点之间比较差异有显著性(P<0.05).结论 血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清可有效诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.Myocmxtin在此分化过程中可能起了重要作用.
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糖尿病大鼠膀胱平滑肌的表型转化
目的：检测链脲佐菌素造模后9周的糖尿病SD大鼠膀胱平滑肌收缩型标志物和关键调控基因myocardin的表达水平，了解糖尿病大鼠膀胱平滑肌是否发生表型转化。方法32只体质量200~220 g的8周龄雄性SD大鼠随机平均分为糖尿病（DM）组和非糖尿病（NDM）组，9周后取膀胱组织行HE和Masson三色染色观察膀胱组织病理变化，qRT-PCR、Western blotting分别检测膀胱组织平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链收缩型平滑肌标志物及myocardin基因的mRNA和蛋白表达水平。结果 DM组大鼠较NDM组明显消瘦（286.25±71.20 g vs 412.71±102.74 g，P=0.001），多饮、多尿，膀胱中胶原纤维组织增多（P<0.001），myocardin、α-SMA、平滑肌肌球蛋白重链的mRNA和蛋白水平均显著下降（P均<0.05）。结论糖尿病大鼠膀胱平滑肌在造模9周时发生表型转化，引起膀胱平滑肌舒缩障碍，可能在糖尿病膀胱病理变化过程中起重要作用。
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Myocardin分子亚型、表达及活性调控机制的研究进展
心肌素(Myocardin)通过与血清反应因子(SRF)结合成蛋白复合物,调节具有cArG-box基因的转录,主要介导心肌细胞及平滑肌细胞的分化.Myocardin表达与活性异常与许多心血管疾病密切关联.该文主要对Myocardin分子结构亚型、表达及活性调节的研究进展进行了综述.
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Myocardin表达载体的构建
目的 构建表达载体pEGFP-Myoc1,为转染人脐血间充质干细胞,实现其成平滑肌分化提供条件.方法 通过聚合酶链反应(PCR)以pAdApt.myoc1 为模板制备Myocardin目的 基因,通过pEGFP-N1载体线性化以及连接、转化等方法构建真核表达载体pEGFP-Myoc1,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定.结果 正确构建了真核重组表达质粒pEGFP-Myoc1,基因测序结果表明,与Gene Bank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的真核重组表达载体pEGFP-Myoc1,为后续实验提供了基础.
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心肌细胞氧化损伤对myocardin和核因子E2相关因子2的影响
利用过氧化氢(H2O2)建立大鼠心肌细胞氧化损伤模型;观察心肌细胞氧化损伤过程中myocardin和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达变化并初步探讨myocardin对Nrf2的影响.通过转染质粒过表达目的基因,转染shRNA质粒下调目的基因表达;通过磺酰罗丹明B(SRB)比色法检测细胞增殖,通过Real-time PCR检测mRNA的表达,通过Western blot检测蛋白的表达.结果显示200μmol/LH2O2孵育24h为佳H2O2氧化损伤条件;H2O2抑制myocardin mRNA及蛋白的表达,同时增加Nrf2 mRNA及蛋白的表达;过表达myocardin基因或者下调Nrf2基因后相对活细胞数较对照组明显减少,而下调myocardin基因或者上调Nrf2基因后相对活细胞数较对照组明显增多;过表达myocardin基因后检测到Nrf2 mRNA和蛋白表达出现明显下调,而下调myocardin基因后检测到Nrf2 mRNA和蛋白表达明显上调.因此推断myocardin基因可能抑制细胞增殖,而Nrf2基因可能促进细胞增殖;H2O2造成大鼠心肌细胞氧化损伤过程中激活Nrf2相关抗氧化损伤信号途径,其机制可能是通过下调myocardin的表达而实现的.
关键词： 心肌细胞 H9c2细胞 过氧化氢 Myocardin 核因子E2相关因子2
