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犬平滑肌样细胞和胶原包埋PGA支架组织的相容性
目的 研究骨髓间充质干细胞所诱导的犬平滑肌样细胞和胶原包埋聚羟基乙酸(PGA)支架的组织相容性.方法 胶原包埋PGA构建复合支架,犬骨髓间充质干细胞诱导血管平滑肌样细胞,评价组织相容性.结果 HE染色见胶原包埋PGA组有平滑肌样细胞生长;甲苯胺蓝染色见平滑肌样细胞被染成浅蓝色,胶原包埋PGA组较单纯PGA组明显增多;电镜观察,胶原包埋PGA组可见到细胞在支架上贴附和生长良好.结论 细胞和胶原包埋PGA的支架组织相容性良好.
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不同质量浓度时转化生长因子β1将如何诱导大鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞的分化
背景:在内膜损伤后炎症反应的过程中,间充质干细胞可以从骨髓释放到病灶处,参与损伤修复.但目前尚缺乏在细胞水平对转化生长因子β1如何促进骨髓间充质干细胞转化为平滑肌样细胞的分子机制研究.目的:揭示体外实验条件下,血管急性损伤时不同质量浓度转化生长因子β1如何诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.设计、时间及地点:随机对照动物实验,体外诱导细胞观察,于2008-01/2009-05在上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级实验动物中心和上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成.材料:雄性SD大鼠24只,随机分为正常对照组、模型组,12只/组.另取4周龄雄性SD大鼠6只,用于分离制备骨髓间充质干细胞.方法:①模型组大鼠建立颈总动脉急性损伤模型.取正常对照组及模型组大鼠损伤后1,3,7 d的血清,运用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中转化生长因子β1的水平.②第1次传代后的大鼠骨髓间充质干细胞以(1.0～3.0)×10~5个/100 mm培养皿的密度接种,设立2组:常规培养组仅加入含体积分数为20%的胎牛血清高糖DMEM基础培养液;转化生长因子β1诱导组在常规培养组基础上,分别给予1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导1周.主要观察指标:损伤后血清中转化生长因子β1的表达;相差倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化:平滑肌细胞标志物α-肌动蛋白的表达.结果:①正常对照组大鼠血清中转化生长因子β1的质量浓度较低;模型组大鼠损伤后1 d血清中转化生长因子β1的质量浓度即已升高,损伤后3 d达高峰,损伤后7 d明显下降,但仍未完全恢复到基础水平.②骨髓间充质干细胞经转化生长因子β1诱导1周后,细胞融合成片,形成峰谷样外观.③免疫细胞化学检测结果显示,与常规培养组比较,1,3,5,10 μg/L转化生长因子β1诱导组平滑肌细胞分化率均明显增加,尤其是5,10μg/L转化生长因子β1诱导组差异有显著性意义(P＜0.01).实时定量PCR结果与免疫细胞化学检测结果相似.结论:急性血管损伤后大鼠血清中转化生长因子β1呈高表达,并在损伤后3 d达高峰.在体外,经类似此高峰浓度的转化生长因子β1诱导后,对骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化有较好的促进效应.
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反义Smad3阻断TGF-β1信号转导对大鼠BMSC分化成平滑肌样细胞的影响
目的 研究信号蛋白Smad3在TGF-β1促大鼠骨髓间充质干细胞分化成平滑肌样细胞中的作用.方法 运用免疫细胞化学、RT-PCR证实BMSC中存在TGF-β1/smad3信号传导通路的基础上,运用反义Smad3进行干预.实验分三组:反义Smad3组(反义Smad3腺病毒转染大鼠BMSC),空载对照组(空载腺病毒转染大鼠BMSC)及未转染组;三组均予10 ng/mL浓度的TGF-β1诱导1 W.通过免疫细胞化学和实时定量PCR比较反义Smad3干预后各组SMa-actin的表达变化.结果 经免疫细胞化学法、RT-PCR检测证明BMSC中存在TGF-β1/smad3表达.运用针对靶基因Smad3的反义技术干预后.经10 ng/mLTGF-β1诱导,相比未转染组及空载组,反义smad3腺病毒转染组SMa-actm阳性细胞表达数明显减少,实时定量PCR也显示反义smad3组SM a-actm mRNA的相对含世明显低己于未转染组(0.460±0.259 vs 2.932+0.375,P＜0.01),而空载组与未转染组相比无明显统计学差异.结论 TGF-β1促BMSC成平滑肌样细胞分化的过程中受Smad3选择性调节,Smad3可能是TGF-β1促BMSC分化成平滑肌样细胞的细胞内信号途径.
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犬骨髓多能成体祖细胞的体外培养、鉴定及向平滑肌样细胞的诱导分化
目的:探讨犬骨髓多能成体祖细胞(MAPC)的体外培养条件、生物学特性及其向平滑肌样细胞分化的可能性.方法:观察体外培养犬骨髓多能成体祖细胞的形态、生长情况,检测其表面标志,利用流式细胞技术检测MAPC的生长周期及特异表面标志表达率;并以分化培养基诱导培养,采用RT-PCR方法检测骨髓多能成体祖细胞OCT-4及分化细胞SM-MHC(smooth muscle cells-myosin heavy chain)表达;检测分化细胞有无平滑肌细胞表面标志的表达.结果:光镜下观察犬骨髓多能成体祖细胞体积偏大,长多角型,数个细长伪足,细胞核大,胞质丰富,细胞增殖能力旺盛;表达表面标志CD13和SSEA-1,不表达CD44、CD45、CD133和MHCⅡ;RT-PCR结果显示表达OCT-4.诱导分化后,分化细胞表达平滑肌细胞表面标志--α-SMA、calponin、SM-MHC;RT-PCR结果显示表达SM-MHC.结论:体外成功培养犬骨髓多能成体祖细胞,具有与文献报道类似的生物学特征;MAPC在一定诱导条件下具有向平滑肌样细胞分化的潜能.
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微创性损伤诱发晶状体上皮向平滑肌样细胞分化的探讨
目的 建立微创性白内障动物模型,探讨晶状体上皮向平滑肌样细胞的分化.方法 4～6周C57BL/6j小鼠24只,随机分为实验组和对照组.实验组采用微创穿破晶状体后囊膜,注入10 μL PBS;对照组仅玻璃体腔内注射等量的PBS,术后行眼部检查及裂隙灯照相.术后第3、7、14、28 d取眼球,行组织病理学观察及平滑肌肌动蛋白(SMA)、波形纤维蛋白(Vim)免疫组织化学染色.结果 术后1～3 d,实验组11只眼晶状体相继发生不同程度的白色混浊.混浊眼球术后3 d,组织病理学观察示晶状体赤道区上皮开始沿创口处爬行;7 d后囊下梭形细胞层增多3～6层,细胞体积增大.14～28 d梭形细胞层数基本保持不变.免疫组织化学染色显示增生的梭形细胞SMA强阳性,Vim阴性.对照组均无上述变化.结论 微创性损伤晶状体出现白内障,能诱发晶状体上皮向平滑肌样细胞分化.
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肝血管平滑肌脂肪瘤的影像学征象
肝血管平滑肌脂肪瘤(HAML)顾名思义主要由血管、平滑肌和脂肪3种成分组成,典型的结构为分化不同阶段的平滑肌样细胞与脂肪细胞的相混杂,点缀着畸形的血管.肾脏血管平滑肌脂肪瘤多见,发生于肝脏者极少.
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TGF-β1在低氧诱导肺动脉内皮细胞向平滑肌样细胞转分化中的作用
目的 研究低氧条件下肺动脉内皮细胞(PAEC)向平滑肌样细胞的转分化及转化生长因子β1(TGF-β1) 在此转分化过程中的作用.方法 将经免疫磁珠法(用血小板内皮细胞粘附分子1做免疫分选标记)纯化后的原代肺动脉内皮细胞分别在常氧(含21%O2、5%CO2、74%N2)和低氧(含1%O2、5%CO2、94%N2)条件下培养1、4、7 d,用核酸干扰法(RNAi)阻断TGF-β1的表达,用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)和Western blot分别检测各组细胞TGF-β1mRNA和蛋白的表达,并用免疫细胞化学法检测平滑肌细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin )的表达,结合形态学观察从而判定有无平滑肌样细胞的转分化.结果 低氧可增加肺动脉内皮细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05),RNAi沉默TGF-β1 基因表达后可明显降低其mRNA和蛋白含量(P＜0.05),随着低氧培养时间的延长,肺动脉内皮细胞转分化为平滑肌样细胞的比率逐渐增加(P＜0.05);阻断TGF-β1表达后,平滑肌样细胞的转化率明显降低(P＜0.05).结论 肺动脉内皮中存在具有转分化为平滑肌样细胞潜能的细胞;低氧可明显促进转分化,TGF-β1在此转分化过程中起重要作用.
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bFGF和PDGF-BB对内皮祖细胞分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞增殖和迁移的影响
目的 探讨内皮祖细胞分化的内皮样和平滑肌样细胞在碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB作用下的增殖和迁移能力.方法 将分离、培养及纯化的内皮祖细胞培养5天后进行分组:对照组、碱性成纤维生长因子组和血小板源长因子BB组.对照组使用20%胎牛血清的DMEM培养基;碱性成纤维生长因子组和血小板源生因子BB组在20%胎牛血清的DMEM培养基中分别添加碱性成纤维生长因子(30μg/L)和血小板源生长因子BB(40μg/L).免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞以及检测内皮祖细胞内皮方向分化标记物CD31和vWF,及平滑肌方向分化标记物α-SMA和Calponin.将分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞用MTF法和Transwell小室分别检测其增殖活性和迁移能力.结果 与对照组比较,内皮祖细胞经碱性成纤维生长因子或血小板源生长因子BB诱导后呈现较强的内皮细胞(CD31,vWF)或平滑肌细胞(α-SMA,Calponin)的荧光染色,被诱导细胞分别称为内皮样细胞和平滑肌样细胞;碱性成纤维生长因子促进内皮样细胞和血小板源生长因子BB促进平滑肌样细胞增殖的作用在一定范围内具有时间(0～48 h)和浓度(碱性成纤维生长因子:0～16μg/L;血小板源生长因子BB:0～18 μg/L)依赖效应.结论 碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB分别可以促进内皮祖细胞分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞,并且在碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB作用下具有明显的增殖和迁移能力.
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低密度脂蛋白诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的作用
目的 探讨低密度脂蛋白诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化及myocardin在其分化过程中的作用.方法 不同浓度血清培养骨髓间充质干细胞条件下加以低密度脂蛋白刺激.细胞分为常规培养组,常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L), 20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组.免疫细胞化学检测myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链的表达、RT-PCR法检测myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌钙结合相关蛋白mRNA的表达.结果 免疫细胞化学结果显示常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L),20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组分别与常规培养组比较myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链的表达增强(P<0.05);20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组与20%胎牛血清组比较上述三种蛋白表达增强(P<0.05);平滑肌肌动蛋白及平滑肌肌球蛋白重链蛋白的表达与myocardin表达呈正相关(r=0.9018,P<0.05;r=0.7969,P<0.05).RT-PCR结果显示常规培养+低密度脂蛋白刺激组(25 mg/L), 20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组分别与常规培养组比较myocardin、平滑肌肌动蛋白及平滑肌钙结合相关蛋白mRNA表达明显增强(P<0.05);20%胎牛血清培养组, 20%胎牛血清+低密度脂蛋白刺激组比较上述三个指标的表达也增强(P<0.05).平滑肌肌动蛋白、平滑肌钙结合相关蛋白mRNA表达与myocardin正相关(r=0.9295,P<0.05;r=0.8940,P<0.05).结论 高浓度血清,低密度脂蛋白均可诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化,低密度脂蛋白联合20%胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的作用强.myocardin可能在此过程中起重要作用.
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小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向平滑肌样细胞分化过程中myocardin的表达
目地 探讨血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为平滑肌细胞的可行性及myoeardin在此过程中的表达变化.方法 采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞,血小板源性生长因子BB(50μg/L)联合高浓度胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞,分别于诱导前,及诱导4 d和8 d后用免疫细胞化学法检测细胞平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和mytraudin的表达.结果 免疫组织化学显示,诱导前及诱导4 d和8 d时,平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和myoeardin三种蛋白的表达逐渐增强,平均灰度值逐渐降低.不同时间点之间比较差异有显著性(P<0.05).结论 血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清可有效诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化.Myocmxtin在此分化过程中可能起了重要作用.
