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朝藿定C诱导C3H小鼠胚胎间充质干细胞向内皮样细胞分化的研究
目的 研究朝藿定C (Epimedin C)诱导C3H小鼠胚胎间充质干细胞(murine embryonic mesenchymal stem cells,C3H/10T1/2)内皮样分化作用.方法 体外培养C3 H/10 T1/2细胞,MTT法和结晶紫法检测不同浓度下朝藿定C对细胞的毒性作用;显微镜下观察朝藿定C诱导后的细胞形态变化;采用流式细胞仪检测朝藿定C对细胞周期分布的影响;采用半定量PCR检测血管内皮细胞标志物CD31、CD34、血管内皮细胞锌指1(vascular endothelial zinc finger 1,Vezf1)、血管生成素1(angiopoietin 1,Ang1)、血管生成素2(angiopoietin 2,Ang2)mRNA的表达;采用免疫细胞化学染色法检测血小板内皮黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)、细胞外-5'-核苷酸酶(ecto-5'-nucleotidase,CD73)、内皮细胞特异性分子-1(endothelial cell specific molecule-1,ESM-1)、整合素β5(integrin β5)的表达.结果 朝藿定C在浓度1～30μmol/L时,不影响C3H/10T1/2细胞的存活率.30 μm ol/L处理24 h后,对细胞周期无明显影响.朝藿定C能诱导C3H/10T1/2细胞向血管内皮细胞分化,使细胞呈明显漩涡状排列.PCR检测结果显示,与干预前比较,经诱导5天后的C3H/10T1/2细胞血管内皮细胞标志因子、CD34、Vezf1、Ang1、Ang2 mRNA水平明显增加(P＜ 0.05,P＜0.01);细胞免疫化学染色结果显示诱导5天后的C3 H/10T1/2细胞血管内皮细胞标志性蛋白CD31、CD73、ESM-1均呈阳性表达,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05).结论 朝藿定C能诱导C3 H/10 T1/2细胞向血管内皮样细胞分化.
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成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞
目的通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞,体外定向诱导分化为血管内皮样细胞,探讨为组织工程血管的构建提供种子细胞的可能性.方法收集骨髓血,提取单个核细胞进行体外培养扩增,用含10 μg/L VEGF培养液诱导细胞,利用免疫组织化学、流式细胞仪技术、电镜技术、放射免疫技术鉴定和观察细胞特性.结果分析了5个标本,每个标本体外扩增10代可获细胞数为8×1010个左右;诱导14 d后细胞VWF强阳性表达,接近汇合的细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态,透射电镜显示胞质内可见大量吞饮小泡,细胞接种在细胞外基质凝胶(ECMgel)中可形成毛细血管样结构,细胞上清液中6-酮-前列素F1α含量为(29.939±19.935)μg/(109·L).结论实验结果提示利用本实验方法,可以获得足够量较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞, 间充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞.
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鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导分化为内皮样细胞
目的:探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)的分离培养和血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其定向诱导为内皮样细胞(ELCs)的可行性.方法:采用Percoll(1.073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养基贴壁纯化培养,倒置显微镜、免疫细胞化学法、流式细胞仪、MTT法、透射电镜(TEM)联合对rBMMSCs形态、表型、生长曲线、细胞周期以及超微结构进行鉴定;诱导后的细胞,采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法检测CD31、CD144(VE-cadherin)和CD34表达以及摄取Dil-acLDL、结合FTIV-UEA-1的功能特点.结果:rBMMSCs呈长梭形,漩涡状排列.细胞生长曲线显示潜伏期、对数生长期和平台期,符合干细胞的生长规律.透射电镜结果表明:rBMMSCs有两种不同的形态结构,其中体积较小、核质比大、胞质内细胞器稀少者为处于未分化或分化较低状态的幼稚型rBMMSCs.细胞周期分析显示:第4代细胞CO/Gl期为95.67%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态;诱导后的部分细胞形态可见类似ELCs改变,表达血管内皮细胞(ECs)特异性表面标志CD31、CD34和(3)144,具有摄取Dil-ac-LDL以及结合FITC-UEA-1的功能特点.结论:采用Percell密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法所培养的rBMMSCs在体外具有定向诱导分化为ELCs的潜能,可能成为血管组织工程理想的种子细胞来源.
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体外心肌梗死微环境下大鼠骨髓间充质干细胞向内皮样细胞的分化
背景:间充质干细胞来源于中胚层,具有多向分化的能力.有研究显示骨髓间充质干细胞有向内皮细胞分化的能力,从而有助于心肌梗死后心脏新生血管的形成和心肌修复.目的:观察骨髓间充质干细胞体外成内皮样细胞分化的特点,以及体外模拟心肌梗死微环境对骨髓间充质干细胞向内皮样细胞分化的影响.方法:骨髓取自SD大鼠股骨和胫骨,骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增,对其形态学、增殖能力及多向分化能力进行鉴定;建立大鼠心肌梗死模型,制备8 h、3 d、1周、2周、4周梗死后不同时间点心肌组织的匀浆,分别加入到由血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子β、胰岛素样生长因子1组成的内皮细胞诱导体系中,共同诱导2周后,观察不同时间的心肌组织匀浆对骨髓间充质干细胞增殖和成内皮分化的影响,检测vWF特异性抗原及表达的阳性率.结果与结论:通过对培养细胞的形态学及功能鉴定,证明其为骨髓间充质干细胞,并具有成骨、成脂肪细胞、成内皮样细胞分化的能力.加入生长因子诱导体系诱导后的细胞部分表达vWF,梗死心肌匀浆与生长因子共同作用,能促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,vWF阳性率提高(P < 0.05).RT-PCR显示加入梗死1周心肌组织匀浆诱导的骨髓间充质干细胞其vWF阳性表达率高.提示骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化能力的有别于造血干细胞的另一种骨髓干细胞.骨髓间充质干细胞具有向内皮分化的能力,且加入梗死心肌组织匀浆的诱导体系在体外可促进骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化.应用骨髓间充质干细胞治疗的佳时机在1周为宜.
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内皮样细胞与脐静脉内皮细胞的比较
背景：干细胞可诱导分化为内皮样细胞，用于治疗糖尿病下肢血管病变，但诱导后的内皮样细胞是否完全可以取代内皮细胞改善血管病变呢？内皮样细胞与内皮细胞有哪些异同？尚未得到解决。目的：探讨诱导后的内皮样细胞与脐静脉内皮细胞在形态、功能及活性方面的异同。方法：分离、培养脐带间充质干细胞及脐静脉内皮细胞，分别通过流式细胞仪及免疫组化进行鉴定，将分离出的脐带间充质干细胞用含10μg/L血管内皮生长因子、10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及体积分数为2%胎牛血清的DMEM-LG/F12培养液向内皮样细胞方向诱导分化并用免疫组化进行鉴定，通过细胞迁移、活性物质测定及三维血管形成实验对内皮样细胞及内皮细胞进行比较。结果与结论：分离的脐带间充质干细胞经流式及免疫组化鉴定高表达间充质干细胞相关表面标志，脐静脉内皮细胞经免疫组化鉴定高表达CD31和VWF。脐带间充质干细胞经诱导液诱导后，进行免疫组化鉴定高表达CD31和VWF。细胞迁移、活性物质及三维血管形成实验均显示诱导后的内皮样细胞在功能及活性上与内皮细胞相似，且优于内皮细胞。
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中文文摘
1．双因子诱导轴型支架血管化的组织形态学研究／李受益…／／华西口腔医学杂志．-2013，31（2）．-205-208
将18只3月龄成年雄性新西兰大耳兔随机分为3组：实验组（8只）、实验对照组（8只）和空白对照组（2只）。解剖分离兔的股动静脉血管束，将其包裹于溶液浇铸-颗粒沥取法制备的同轴双层 PLGA 支架中央。实验组支架的外层加注 PDGF，内层加注 VEGF；实验对照组支架的外层为空白，内层加注 VEGF；空白对照组不予特殊处理。实验组及实验对照组于支架植入术后第7、10、14、21天观察新生血管的形态特征，空白对照组于支架植入术后第7、10天观察作为对照。结果：术后第7天，实验组及实验对照组股动静脉血管束可见少量呈放射状分布的血管芽；术后第10天，两组大量的新生血管芽沿支架孔隙空间向内层支架放射状生长并贯通支架全层，密度由内向外梯度递减；术后第14天，实验组血管壁较厚，呈分层结构，实验对照组以单层内皮样细胞衬里的幼稚血管为主；术后第21天，实验组支架内以成熟血管为主，而实验对照组血管数量明显减少。空白对照组始终未见明显血管结构。结论：同轴双层 PLGA 支架复合VEGF／PDGF可有效促进早期血管化。 -
骨髓基质细胞源内皮样细胞对微血管新生的影响
目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)源内皮样细胞移植对大鼠局灶性脑损伤血管生成的影响,探讨BMSCs源内皮样细胞移植修复大鼠脑损伤的机制.方法 制备大鼠局灶性脑损伤动物模型,进行BMSCs源内皮样细胞移植,通过ELISA、免疫组织化学、电镜等观察局部血管内皮细胞生长因子(VEGF)、内皮细胞及微循环的变化.结果 BMSCs源内皮样细胞移植后,局部VEGF水平升高、凝血因子FⅧ染色阳性细胞数增加,染色加深；局部微血管内膜较光滑,细胞核形态较规则,基底膜较完整,微血管管腔受压缓解.结论 BMSCs源内皮样细胞移植促进损伤区周围内皮细胞增殖和新生血管形成,损伤区局部微循环得以改善.
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体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究
目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05)；电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.
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bFGF和PDGF-BB对内皮祖细胞分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞增殖和迁移的影响
目的 探讨内皮祖细胞分化的内皮样和平滑肌样细胞在碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB作用下的增殖和迁移能力.方法 将分离、培养及纯化的内皮祖细胞培养5天后进行分组:对照组、碱性成纤维生长因子组和血小板源长因子BB组.对照组使用20%胎牛血清的DMEM培养基;碱性成纤维生长因子组和血小板源生因子BB组在20%胎牛血清的DMEM培养基中分别添加碱性成纤维生长因子(30μg/L)和血小板源生长因子BB(40μg/L).免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞以及检测内皮祖细胞内皮方向分化标记物CD31和vWF,及平滑肌方向分化标记物α-SMA和Calponin.将分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞用MTF法和Transwell小室分别检测其增殖活性和迁移能力.结果 与对照组比较,内皮祖细胞经碱性成纤维生长因子或血小板源生长因子BB诱导后呈现较强的内皮细胞(CD31,vWF)或平滑肌细胞(α-SMA,Calponin)的荧光染色,被诱导细胞分别称为内皮样细胞和平滑肌样细胞;碱性成纤维生长因子促进内皮样细胞和血小板源生长因子BB促进平滑肌样细胞增殖的作用在一定范围内具有时间(0～48 h)和浓度(碱性成纤维生长因子:0～16μg/L;血小板源生长因子BB:0～18 μg/L)依赖效应.结论 碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB分别可以促进内皮祖细胞分化成内皮样细胞和平滑肌样细胞,并且在碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB作用下具有明显的增殖和迁移能力.
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体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为内皮样细胞
[目的]研究人骨髓间质干细胞(hMSC)的生物学特性和体外诱导分化为内皮样细胞的可能.[方法]抽取人胸骨的骨髓,进行hMSC的分离、纯化及培养,进行成骨,成脂鉴定.体外用细胞因子诱导hMSC分化为内皮样细胞,分为A组:诱导剂为L-DMEM含有体积分数2%胎牛血清(FCS),50 ng/mL血管内皮生长因子(VEGF);B组:诱导剂是L-DMEM含有体积分数2%FCS,50ng/ml VEGF和2 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),均诱导21 d.用免疫荧光的方法检测是否表达内皮细胞特异性标志物VWF,CD31,VCAM1;透射电镜观察有无内皮细胞特征性超微结构.[结果]来源于人胸骨的hMSC能被诱导成成骨细胞,脂肪细胞.体外诱导后表达内皮细胞特异性标志物,其中B组诱导率高于A组.B组细胞VWF阳性率约80%～90%,A组仅10%;透射电镜显示B组细胞具有内皮细胞特征性超微结构,如W-P小体.[结论]胸骨骨髓来源的人骨髓间质干细胞可以在体外被VEGF和bFGF联合诱导分化为内皮样细胞,诱导率高于单用VEGF.
关键词： 人间质干细胞 内皮样细胞 血管内皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子 -
鼠胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞
目的 采用简单贴壁培养方法诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为内皮样细胞,为组织工程血管及细胞替代治疗提供新的种子细胞.方法 小鼠ESC株SV129按2×104个/cm2密度传代培养,采用ESC培养基添加1 000 U/mL白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)维持其未分化状态.撤除LIF,ESC悬浮培养形成拟胚体(embryoid body,EB),将培养第4天的EB置于含VEGF的培养基中贴壁培养,诱导分化.采用免疫组织化学染色、流式细胞仪分析、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeledacetylated low density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)摄取实验以及透射电镜检查鉴定分化细胞的性质.结果 分化产生的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,能摄取DiI-Ac-LDL.ESC诱导分化培养产生的第15代细胞免疫组织化学染色呈Flk-1和CD31阳性;流式细胞仪检测ESC传至9代后CD31阳性细胞>90%;透射电镜可见怀布尔-帕拉德体及内皮细胞间紧密连接.结论 采用简单贴壁培养的方法,单独使用VEGF即可诱导ESC分化为内皮样细胞.诱导培养方法操作简便,经济实用,可为组织工程血管及细胞替代治疗提供所需内皮样细胞.
