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乳鼠心肌细胞酶消化培养和贴块培养法的比较
目的探索经济、简单易行的心肌细胞培养方法.方法选用新生乳大鼠心肌细胞进行0.25%胰酶分离培养和贴块培养两种培养方法.结果用0.25%胰酶消化培养可获得大量的单细胞,但是酶对细胞的损伤比较大,酶消化所受的影响因素比较多,此过程获取单细胞所需的时间比较长;贴块培养法简便易行,得到的细胞结构完整、存活率高,且经济实惠、适合长期研究且需细胞量不多的实验.结论酶分离培养和贴块培养各有优劣势,应根据不同的实验目的选用不同的培养方法.
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神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤
背景:近年来,神经干细胞移植已成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的研究热点.目的:探讨神经干细的定向分化调控机制和神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤的研究进展.方法:以“neural stem cells,stem cell transplantation,ischemic brain injury”为检索词,检索Pubmed 数据库1990至2012年相关文献;以“神经干细胞,干细胞移植,缺血性脑损伤”为检索词,检索CNKI数据库2005至2012年相关文献.分析神经干细的定向分化调控机制和神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤的内容,排除重复研究.结果与结论:①体外分离培养的神经干细胞有胚胎来源、脐血来源和成体来源,主要采用机械分离法和胰酶消化法进行分离.②目前体外培养的神经干细胞分离鉴定的标记物有巢蛋白、波形蛋白1、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、神经元特异性烯醇化酶等.③神经干细胞的分化调节是通过正负双重作用实现的,负性调节是通过对称性的分裂来增加神经干细胞数量,包括Notch信号途径和一些生长因子等.正性调节诱导神经干细胞分化,包括参与细胞合成的骨形态发生蛋白信号途径等.④神经干细胞移植的时间窗选择在实验动物脑缺血两三周后,时间过早和过晚均不适合细胞的存活.神经干细胞通过脑立体定位仪直接进行脑内移植治疗大鼠局灶性脑缺血损伤,移植后可见细胞在局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活,并可广泛迁移,移植神经干细胞后观察到其运动行为学评分有明显提高.缺血性脑卒中的神经干细胞移植治疗还存在一些问题需要解决,未来的临床应用前景广阔,是缺血性脑卒中患者的新希望.
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不同培养方法对人脐带间充质干细胞的影响
背景：脐带干细胞培养主要来源于足月儿，常用培养方法包括组织贴块法、胰酶消化法，但是对于不同培养方法对脐带间充质干细胞的分离结果尚存在较大的争议。目的：观察不同培养方法对脐带间充质干细胞的影响。方法：取30例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带，采用组织贴壁法和胶原酶-胰酶消化法进行培养，制备细胞悬液，获得人脐带间充质干细胞进行分离培养，在流式细胞仪上测定细胞生长情况。结果与结论：①细胞融合情况：脐带经过组织贴壁法原代培养5d后，细胞开始从脐带组织分离，呈现梭形，培养10 d后细胞融合达到80%，脐带经胶原酶-胰酶消化法培养5 d后，可见少量形态各异的贴壁细胞分布，纤维样细胞培养2周后培养融合才达到80%；②细胞生长情况：两种不同培养方法分离出的脐带间充质干细胞生长情况差异无显著性意义(P>0.05)；③细胞鉴定结果：两种培养方法培养的细胞CD13，CD29，CD44及CD105标志物表达均为阳性。④结果说明：人脐带间充质干细胞采用组织贴壁原代培养法培养成功率高，优于胶原酶-胰酶消化法培养。
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胎鼠脊髓神经干细胞分离方法的比较
目的:比较机械法和胰酶消化法对胎鼠脊髓源神经干细胞增殖分化的影响.方法:分别用机械法和胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞,应用台盼蓝检测细胞成活率,用无血清培养技术培养神经干细胞,应用MTT法检测细胞分裂增殖能力,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化细胞.结果:机械法获得的细胞数量多于胰酶消化法.细胞经过培养其增殖能力机械法略强于胰酶消化法,但无统计学意义.培养形成的细胞球Nestin阳性,诱导分化后可见NSE和GFAP阳性细胞.结论:运用机械法比胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞方法简单,容易操作,经过培养细胞增殖能力较强.并可提供健康的细胞来源.
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机械吹打法、胰酶消化法分离新生大鼠脑组织神经干细胞效果观察
目的 对比观察机械吹打法、胰酶消化法分离培养新生大鼠脑组织神经干细胞(NSCs)的效果.方法 取出生3天的新生SD大鼠大脑皮质,分别用机械吹打法、胰酶消化法分离培养(分别记为机械吹打组和胰酶消化组),通过免疫荧光法对NSCs进行鉴定和诱导分化;分别于培养第2、5、7天计数细胞球直径及数目;通过MTT法检测两组原代及第3亚代细胞的克隆增殖能力;选取第3亚代细胞进行冻存、复苏,计算细胞复苏后的存活率.结果 两组均可从新生SD大鼠大脑皮质分离得到NSCs,并均可诱导分化为神经元、神经胶质细胞.培养5、7天时,机械吹打组获得的细胞球数量和直径均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均＜0.05).机械吹打组原代细胞培养2、5、7天细胞克隆增殖能力均高于相同培养时间的胰酶消化组(P均＜0.05),第3亚代细胞培养2、5天细胞克隆增殖能力均优于相同培养时间的胰酶消化组(P均＜0.05).两组第3亚代细胞冻存、复苏后存活率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 机械吹打法、胰酶消化法均可成功分离培养、诱导分化新生大鼠NSCs,机械吹打法分离培养的NSCs克隆增殖能力高于胰酶消化法.
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外源性硫化氢对肢体缺血再灌注所致中性粒细胞肺内黏附的作用
近来研究表明,硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3种气体信号分子[1].本研究旨在观察外源性H2S对肢体缺血再灌注(IR)所致肺中性粒细胞(PMN)与肺微血管内皮细胞(PMVEC)黏附的作用.一、材料与方法1.PMVEC细胞株购自Clonetics公司.应用胰酶消化法传代,在细胞亚融合时进行实验.
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热休克诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞中的表达及其抗氧自由基损伤作用
目的:观察血红素加氧酶-1(heme oxygenase, HO-1)基因在热休克处理的乳鼠心肌细胞中的表达及其抗氧自由基损伤的作用.方法:取生后2～3 d的Wistar鼠若干,雌雄不限,摘取心脏,剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小,胰酶消化法分离、培养乳鼠心肌细胞,一周后,将细胞分别在42℃热休克处理0.5 h,1 h,3 h,5 h,提取细胞总RNA,以Northern杂交技术观察HO-1基因在乳鼠心肌细胞中的表达及其时间依赖性关系.同时以黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统作用于热休克处理5 h的乳鼠心肌细胞,通过测定细胞的HDL释放量、MDA生成量及细胞存活率以观察HO-1基因表达后的抗氧自由基损伤作用.结果:热休克能够诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞表达,其表达量随热休克时间的延长而相应增加,具有明显的时间依赖性关系;同时心肌细胞的抗氧自由基损伤能力增强表现为,与对照组相比,细胞的LDH释放量、MDA生成量明显降低及细胞存活率明显增加.而此保护效应在应用HO-1的特异性抑制剂后可被部分阻断,表明HO-1基因的表达是热休克诱导细胞保护作用的重要机制之一.
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氯高铁血红素诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞中的表达及其细胞保护作用
目的:观察血红素加氧酶-1(heme oxygenase, HO-1)的底物氯高铁血红素诱导培养的乳鼠心肌细胞HO-1基因表达的规律,以及该基因的表达对心肌细胞过氧化损伤的作用. 方法:取生后2～3 d的Wistar鼠若干,雌雄不限,摘取心脏,剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小,胰酶消化法分离、培养乳鼠心肌细胞后,以不同浓度的氯高铁血红素孵育1 h;以及在20 μmol/mL浓度下分别孵育不同时间,提取细胞总RNA,以Northern杂交技术观察氯高铁血红素诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞表达的剂量依赖性和时间依赖性.同时以黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统作用于氯高铁血红素诱导的心肌细胞,通过测定细胞的LDH释放量、MDA生成量及细胞存活率以研究HO-1表达后的抗自由基损伤作用.结果:在培养的乳鼠心肌细胞,氯高铁血红素可以诱导HO-1表达,两者之间存在着浓度依赖性和时间依赖性关系;而且该基因的表达增高能够增强乳鼠心肌细胞抗氧自由基损伤的能力,表现为与对照组相比,细胞的LDH释放量、MDA生成量明显降低及细胞存活率明显增加.这种保护作用可以被HO-1的特异性抑制剂部分阻断,说明HO-1基因表达具有一定程度的抗心肌细胞过氧化损伤的作用.
