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外源表达miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响
目的 研究miR-34a对H1299细胞辐射敏感性的影响.方法 采用pre-miR-34a瞬时转染H1299细胞,接受不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基因bcl-2、bax、CDK4、CDK6及cyclinD1的表达水平.结果 不同剂量(0、2、4、6和8 Gy)γ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组各剂量点细胞活力明显降低(t=-2.39、-3.12、-4.98、-4.03、-3.06,P＜0.05),并与阴性对照转染组的差值呈剂量依赖性的增加.6 Gyγ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组细胞凋亡率明显增加(t=7.06,P＜0.05),细胞G0/G1期阻滞(t =3.94,P＜0.05),S期细胞减少(t=6.23,P＜0.05),bcl-2、CDK4及CDK6明显下调(t=3.39、12.88、6.21,P＜0.05),cyclinD1有下降趋势,但差异无统计学意义,而bax明显上调(t=-4.35,P＜0.05),是阴性对照转染组的1.94倍,bcl-2/bax比值下降.结论 miR-34促进H1299细胞凋亡,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞活性,进而提高H1299细胞的辐射敏感性.
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YY1基因在肺癌组织中的表达及其对肺癌细胞功能的影响
目的：检测转录因子YY1在肺癌组织中的表达情况，并分析其对肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的影响。方法应用Taqman探针实时荧光定量PCR方法检测235例肺癌组织以及62例配对癌旁组织中YY1 mRNA的表达，并分析其表达与患者临床病理特征的关系。应用Lipofectamine 3000试剂在肺癌细胞系转染YY1过表达质粒及对照质粒。噻唑蓝（MTT）分别检测对照组和YY1过表达组在24、48及72 h时A549和H1299细胞增殖能力的变化。划痕实验和Transwell实验检测YY1过表达对肺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果与癌旁组织（5.80±0.58）相比，YY1 mRNA在肺癌组织（5.07±0.58）中表达下调（P<0.01），且YY1 mRNA的表达在不同性别、吸烟状态、病理类型及临床分期中差异有统计学意义（P<0.05）。YY1过表达组H1299细胞增殖能力在48 h和72 h均低于对照组（P<0.01），A549细胞在72 h低于对照组（P<0.05）。划痕实验和Transwell实验结果显示转染过表达YY1质粒后，肺癌细胞的侵袭能力及迁移能力明显下降（P<0.05）。结论 YY1在肺癌组织中低表达，上调YY1的表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
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ULF基因沉默对依托泊苷引起的非小细胞肺癌H1299细胞凋亡的影响
目的：探讨RNA干扰靶向抑制ULF的表达对化疗药物依托泊苷（etoposide）引起的非小细胞肺癌H1299细胞凋亡的影响。方法设计3条针对ULF基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）片段及1条阴性对照siRNA，分别在慢病毒载体介导下感染H1299细胞。用real-time PCR及Western印迹法筛选出1条抑制效率高的ULF序列，对有效干扰组和对照干扰组细胞进行etoposide处理，干扰对照细胞或沉默ULF的H1299细胞，用c-PARP做标记物检测H1299细胞的凋亡程度，MTT法检测H1299细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期分布。结果经感染ULF-shRNA-1序列的H1299细胞中ULFmRNA及蛋白表达降低为明显，抑制率达80％，选择该条siRNA作为有效干扰组进行后续实验。Western blot结果显示etoposide处理后，有效干扰组H1299细胞凋亡水平显著增加，细胞增殖抑制率显著高于对照干扰组，并与etoposide剂量呈正相关，2组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。流式结果显示有效干扰组G0/G1期细胞较对照组增加，S期细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 etoposide处理后通过干扰ULF蛋白表达可诱导H1299细胞的凋亡，抑制细胞增殖，使细胞出现S期阻滞，推测ULF基因可能成为癌症基因治疗的一个新靶点。
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慢病毒介导NIS和TPO基因转染肺癌细胞125I摄入及流出的研究
目的：研究NIS和TPO基因对肺癌细胞放射性碘摄取及流出时间的影响。方法：通过基因亚克隆建立携带NIS和TPO基因的慢病毒载体重组质粒，利用293T细胞包装获得慢病毒液，感染肺癌A549和H1299细胞，用125I观察肺癌细胞摄碘和碘流出时间变化。结果：转染NIS的A549和H1299细胞摄碘时间较原始细胞增加：A549和H1299细胞在含有125I的培养液中随着培养时间的增加，细胞摄碘的量增加，分别在培养30min、60min时细胞摄碘达高峰，A、B组与C组比较差异具有统计学意义（ P<0.05）；共转染NIS/TPO的A549和H1299细胞碘流出时间延长：A组125I外流速度较B组减慢，两组间比较差异具有统计学意义（ P<0.05）。结论：体外肺癌细胞转染NIS基因能明显增加细胞摄取碘能力，转染TPO基因有助于细胞内碘有机化，延长细胞内碘流出时间。
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肿瘤坏死因子α通过非p53依赖途径对NF-κBmRNA表达的影响
[目的]研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)通过非p53依赖途径对NF-κBmRNA表达的影响.[方法]以p53缺失细胞系H1299作为实验工具,MTT检测rmhTNF-α对H1299细胞的抑制.RT-PCR检测NF-κBmRNA表达[结果]单独应用rmhTNF-α对H1299细胞没有抑制.rmhTNF-α浓度为4170U/ml、16680U/ml、20850U/ml时,OD550值与对照组比较有统计学意义(P<0.05);TNF-α在体外诱导了H1299细胞NF-κBmRNA的表达升高.[结论]提示TNF-α通过非p53依赖途径促进NF-κBmRNA的表达升高.
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p53301-393突变体的细胞定位及对有丝分裂的影响
目的:研究p53N端缺失突变体(301-393氨基酸)的绿色荧光融合蛋白p53301-393-GFP在p53阳性和阴性细胞中的定位以及对有丝分裂的影响.方法:免疫印迹检测突变体融合蛋白的表达.将野生型p53-GFP和p53301-393-GFP质粒,分别转染p53阳性细胞株HeLa和p53阴性细胞株H1299,观察各融合蛋白的细胞定位.观察转染突变体后H1299细胞生长情况,计数有丝分裂期的细胞数.HeLa细胞转染突变体后,流式细胞仪检测细胞周期,免疫印迹检测p53蛋白水平的改变.结果:p53301-393-GFP融合蛋白能正确表达.突变体在p53阳性和阴性细胞中都弥散定位于细胞核,但只在p53阳性细胞中才定位于核仁.p53301-393-GFP融合蛋白对H1299细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使进入有丝分裂期的细胞数量明显较对照组减少,且能够诱导凋亡.转染突变体的HeLa细胞产生G2/M期阻滞(P＜0.05),但是内源性p53蛋白水平无明显改变.结论:p53301-393-GFP突变体在p53阳性和阴性细胞中有不同的细胞定位,并能抑制细胞的有丝分裂,使细胞发生G2/M期阻滞.
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二烯丙基二硫化物诱导人肺癌细胞凋亡机制
目的 研究大蒜提取物二烯丙基二硫化物(DADS)诱导人非小细胞性肺癌细胞H1299凋亡及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)对此过程的影响,探讨DADS抗肿瘤的可能机制. 方法用MTT法检测DADS处理24 h后 H1299细胞活性;用蛋白质印迹法测定H1299细胞内磷酸化-p42/44 MAPK的表达.结果 与对照组相比,DADS呈浓度依赖性诱导H1299细胞凋亡;蛋白质印迹法分析显示,DADS可激活p42/44 MAPK,且磷酸化-p42/44 MAPK的表达呈浓度依赖性增加.结论 DADS能诱导H1299人非小细胞性肺癌细胞发生细胞凋亡,并呈浓度依赖性诱导磷酸化-p42/44 MAPK表达.
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RNAi技术沉默Survivin基因抑制肺癌细胞株H1299增殖并诱导其凋亡
目的:研究RNAi技术沉默Survivin基因对人肺癌细胞株H1299增殖和凋亡的影响.方法:将Survivin特异性siRNA表达载体siRNA-Sur转染H1299细胞,利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率,通过Western blot和Realtime-PCR方法检测RNAi沉默Survivin基因表达的效果,MTT法检测RNAi沉默Survivin基因对基因H1299细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡.结果:siRNA-Sur转染H1299细胞48 h后,细胞的Survivin基因表达明显减少,空白对照组Survivin mRNA的相对表达量为1.0,siRNA-空白对照组为0.98,而siR-NA-Sur组为0.32(P ＜0.01);导致H1299细胞G2期阻滞,空白对照组为23.7％,而siRNA-Sur组为50.1％(P＜0.01);细胞抑制率和凋亡率增加,转染48 h,空白对照组凋亡率为5.8％,无关对照组为6.2％,而siRNA-Sur组达50.6％ (P ＜0.01).结论:RNAi沉默H1299细胞Survivin基因表达抑制细胞增殖,并诱导H1299细胞凋亡.
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S期H1299细胞热损伤后的延迟性DNA双链断裂
目的：研究S期细胞热损伤后DNA双链断裂形成规律，以阐明S期细胞热敏感原因，并分析DNA双链断裂延迟性形成的可能机制。方法流式细胞术分析热损伤后细胞周期阻滞；EdU掺入实验检测DNA复制能力；血清饥饿法同步H1299细胞周期；中性彗星实验动态观察热损伤后DNA双链断裂形成；台盼蓝拒染实验研究热损伤后细胞存活率；蛋白免疫印记实验检测ATM磷酸化及DNA结合RAD18情况。结果流式结果显示H1299细胞经45℃热损伤1 h后S期细胞较未加热组明显增多（P<0.01）；热损伤后EdU阳性率随时间变化趋势同S期比例变化；S期细胞热损伤后需经37℃正常孵育一定时间方可观察到“彗星拖尾”现象，且随着正常孵育时间延长，反映DNA双链断裂的尾力矩值越大；台盼蓝拒染实验显示S期细胞受热后7.5 h内死亡率保持较低水平，之后细胞死亡加速；热损伤后ATM磷酸化先增多后减少，热损伤导致DNA结合RAD18明显减少。结论细胞热损伤后可发生S期阻滞，阻滞期间因复制继续、DNA损伤修复抑制而延迟形成的致死性DNA双链断裂是S期细胞热敏感的可能原因。
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重组人源MAPK15基因稳定表达细胞系的构建及其对肺癌细胞迁移的影响
目的:研究MAPK15基因对人肺癌H1299细胞迁移作用的影响.方法:将人源MAPK15克隆到真核表达系统中并通过脂质体法转染H1299;用含有Zeocin抗性的培养基进行筛选,挑取抗性细胞克隆扩大培养;Western blot检测MAPK15蛋白表达;通过划痕和Transwell实验研究MAPK15在H1299中细胞迁移率变化.结果:Western blot表明,挑取的抗性细胞克隆稳定表达MAPK15;划痕和Transwell实验结果显示,有MAPK15高表达的H1299中细胞迁移明显快于对照组.结论:在人肺癌H1299中,MAPK15高表达能促进细胞迁移,这为进一步阐明MAPK15在肺癌发生过程中所起的作用提供了一定的参考依据.
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BH3诱导肺癌H1299细胞凋亡的试验研究
目的 研究肽BH3抗人非小细胞肺癌细胞株H1299的作用,并探讨其作用机制.方法 体外培养H1299细胞,取10 μM、100 μM和1 000 μM浓度的BH3作用于H1299细胞,72 h后,用RT-PCR检测Bcl-2、Capase 3和Bcl-xL的表达变化、测定Capase 3和Capase 9的活性并观察体内外细胞生长的抑制情况.结果 RT-PCR结果 显示,不同浓度的BH3作用后,Bcl-2、Capase 3和Bcl-xL的表达表现出相应变化,Capase 3和9的活性也有增高的趋势.BH3对细胞有明显的抑制作用,24 h后,抑制率分别为2.34%、17.5%、24.46%;48 h后,抑制率分别为8.72%、20.33%、45.17%;72 h后,抑制率分别为13.11%、38.90%、50.24%.BH3(10 μM、100 μM和1 000 μM)对裸鼠移植性非小细胞肺癌细胞株H1299也有抑制作用,3个剂量组的抑瘤率分别为43.85%,54.92% 和59.02%.结论 肽BH3有促进H1299细胞凋亡的作用.降低高表达的Bcl-2和Bcl-xL基因,升高Capase 3基因,可能是BH3抗人非小细胞肺癌的机制之一.
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人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定
目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.
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不同固定液对细胞骨架荧光染色标记效果的影响
目的 比较不同固定液对细胞骨架荧光染色的差异,选择佳固定方法.方法 分别采用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛/MES 4种固定液,对人肺腺癌细胞H1299进行固定,对其微管和微丝荧光标记后,在共聚焦显微镜下观察其形态结构.结果 4%多聚甲醛/MES对细胞的微管和微丝都有很好的固定作用.4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇对细胞的微丝基本能起到固定作用,而4%甲醛对微管的固定效果略差,2%戊二醛、95%乙醇固定的细胞看不到微管的具体形态结构.结论 细胞骨架的固定中需加入骨架稳定剂,且根据实验目的,选择适当的固定液获得佳标记效果.
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二烯丙基二硫化物诱导人肺癌H1299细胞凋亡机理研究
目的:研究大蒜提取物二烯丙基二硫化物(DADS)诱导人非小细胞性肺癌细胞H1299凋亡及细胞周期阻滞对此过程的影响,探讨DADS抗肿瘤的可能机制.方法:MTT法检测细胞活性、Hoechst 33258染色法计数凋亡细胞、流式细胞术检测细胞凋亡率及周期分布.结果:与未处理的对照组相比,DADS可诱导H1299细胞产生典型的凋亡细胞形态学变化,并呈浓度依赖性诱导H1299细胞凋亡;较高浓度的DADS能诱导G2/M期细胞百分率显著升高.结论:DADS能诱导H1299细胞发生细胞凋亡,并诱导H1299细胞发生G2/M期阻滞.
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重离子12C6+辐照对人肺癌细胞增殖的影响
目的:探讨12C6+射线辐照人肺癌细胞株H1299细胞的生物学效应.方法:以不同剂量的12C6+辐照H1299细胞,并培养24,48,72小时收获细胞.采用MTT法检测H1299细胞增殖情况.结果:12C6+辐照H1299细胞后,细胞呈现明显的形态学改变.MTT法检测发现,在一定剂量范围内,随着辐照剂量的增加,H1299细胞的OD值逐渐减少,与假照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:12C6+辐射在2Gy范围内辐照H1299细胞,具有明显抑制其增殖的作用.
