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印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤细胞的放射增敏作用及机制研究
目的 探讨印记基因PHLDA2过表达对骨肉瘤放射敏感性的影响及相关分子机制.方法 通过基因转染技术,将真核表达质粒pEGFP-C3-PHLDA2导入骨肉瘤U2OS细胞,经G418持续筛选获得稳定高表达PHLDA2蛋白的亚克隆细胞.实验分为3组:不转染的空白对照组,U2OS;稳定转染pEGFP-C3质粒的阴性对照组,U2OS-neo;pEGFP-C3-PHLDA2质粒的稳定转染组,U2OS-PHLDA2.采用CKK8比色法测定4和8 GyX射线照射后细胞的增殖活性;克隆形成实验观察0～8 Gy照射后细胞的存活能力;Annexin V/PI染色法检测8 Gy照射后的细胞凋亡;Western blot测定蛋白的表达变化.建立人骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,观察10 Gy照射后PHLDA2基因的体内增敏效应.结果 经筛选获得的骨肉瘤亚克隆U2OS-PHLDA2细胞中PHLDA2蛋白表达上调(t=13.73,16.28,P＜0.05).与U2OS和U2OS-neo组相比,PHLDA2高表达组在4和8 Gy的增殖能力明显降低(t=5.00 ～ 8.23,P＜0.05),2～8 Gy的克隆形成能力明显降低(t=-2.52～-1.26,P＜0.05);同时照后裸鼠移植瘤的生长抑制作用显著提高(=3.27、2.91,P＜0.05).8 Gy照后,PHLDA2高表达组的凋亡率为(17.97±1.69)％,高于U2OS组的(6.47±1.01)％和U2OS-neo组的(7.15±0.96)％(t=10.11、9.61,P＜0.05);同时Caspase-3活性明显提高(t=11.26、10.72,P＜0.05).结论 外源性PHDLA2基因在U2OS细胞中稳定过表达能够提高骨肉瘤对X射线的敏感性,其机制可能是通过增强Caspase-3的活性、促进射线诱导的细胞凋亡作用实现的.
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子痫前期患者胎盘组织PHLDA2基因印迹初步研究
目的 观察子痫前期患者胎盘组织母源性印迹基因PHLDA2印迹状态.方法 收集21例正常妊娠和19例子痫前期患者胎盘组织,抽提样本DNA,PCR扩增,选择PHLDA2基因组变异比例较高的单核苷酸多态性(SNP)位点:rs13390为外显子1中C/T多态性(PHLDA2-1),rs1056819为外显子2中G/A多态性(PHLDA2-2),直接测序筛选杂合子.将杂合子样本的RNA逆转录合成cDNA,PCR扩增直接测序判断PHLDA2基因印迹状态.结果 正常妊娠与子痫前期胎盘PHLDA2-1(外显子1)SNP位点(C/T)均未发现杂合子,全为T/T纯合子;胎盘PHLDA2-2(外显子2)SNP位点(G/A)在子痫前期有4例(4/19)、正常妊娠有5例(5/21)杂合子表达,两组杂合子表达差异无统计学意义(P＞0.05).PHLDA2-2杂合子胎盘组织PHLDA2 cDNA均只表达G单等位基因.结论 子痫前期胎盘PHLDA2(PHLDA2-1及PHLDA2-2)基因多态性与正常妊娠相似,未发现PHLDA2基因印迹丢失现象.
