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热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究
目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用.方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S+pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S); ELISA法测定血清抗HBs抗体; ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h 51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性.结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10.佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2～3倍.CTLs细胞杀伤活性(E∶ T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05).结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂.
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Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力
目的 研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法 在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验.结果 获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的γ-IFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组(P<0.05).融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少(4.36±0.48),提供的保护力与BCG相当(4.30±0.53).结论 Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防.
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6.0×104 a热休克蛋白对冠心病患者一年内心血管事件的预测价值
目的 探讨入院时血清热休克蛋白(HSP) 60、HSP65检测对冠心病患者1年内心血管事件的预测价值.方法 选取南京医科大学附属无锡市人民医院和无锡市第二人民医院2009年11月至2011年2月心内科住院的89例患者作为研究对象,分为急性冠状动脉综合征(ACS)组50例、稳定型心绞痛(SAP)组19例、无冠心病(non-CHD)组20例.测定所有患者入院即刻血清中人HSP60、HSP65浓度.并对所有患者建立随访记录,观察1年内心血管事件的发生情况,并分析其与HSP60、HSP65之间的关系.结果 成功随访84例,失访5例.1年内有心血管事件发生的患者共18例,血清HSP60[(1026.19±253.47) ng/L]、HSP65[(2573.95±768.75) ng/L]的浓度均明显高于无心血管事件发生的患者[(845.75±138.52)、(2076.38±385.46) ng/L],差异有统计学意义(t值分别为2.49、2.58,P均＜0.05).ACS组内有心血管事件发生患者血清中HSP60[(1162.73±249.14) ng/L]、HSP65[(2714.39±738.44) ng/L]的浓度亦均明显高于无心血管事件发生的患者[(892.55±204.62)、(2136.85±472.62)ng/L],差异有统计学意义(t值分别为2.19、2.65,P均＜0.05).经COX回归分析可见HSP65为急性冠状动脉综合征患者近期是否发生心血管事件的独立预测因子(RR=1.002,95％ CI1.000～1.004,P=0.035).结论 人HSP60、HSP65检测在冠心病预后中具有重要的价值,其中HSP65是预测急性冠状动脉综合征患者1年心血管事件发生的独立危险预测因子.
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人乳腺癌融合蛋白疫苗HSP65-HER2的表达、纯化及活性检测
目的:在大肠杆菌中表达、并纯化获得高纯度的融合蛋白疫苗HSP65-HER2.方法:经过酶切和序列分析后,将pET-28a-HSP65-HER2重组质粒转化Ecoli(BL21)中,经IPTG诱导产生6-his tag-HSP65-HER2融合蛋白,并通过Ni Sepharose 4B和Superdex G-25纯化.以纯化的重组融合蛋白免疫小鼠,取脾细胞经体外诱导后,采用CTL活性检测其活性.结果:成功的表达、纯化获得了高纯度的HSP65-HER2融合蛋白,CTL活性检测结果表明具有生物学活性.结论:获得了高纯度的HSP65-HER2融合蛋白,并证明其具有免疫学活性,为进一步研究其生物学活性奠定了基础.
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麻风分枝杆菌热休克蛋白65的表达、纯化及其多克隆抗血清的制备
目的 原核表达、纯化麻风分枝杆菌热休克蛋白65(Heat shock protein 65,HSP65),并制备其多克隆抗血清.方法 以含hsp65基因的真核表达质粒pCMV4.65为模板,PCR扩增hsp65基因,克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET-28a-hsp65,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清,Western blot分析重组蛋白的反应原性.结果 重组表达质粒pET-28a-hsp65经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65 000,表达量约占菌体总蛋白的30%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%,浓度约为1.0 mg/ml;制备的HSP65多克隆抗血清效价可达1:12 800;重组蛋白具有良好的反应原性.结论 已成功表达、纯化了麻风分枝杆菌重组HSP65蛋白,并制备了HSP65多克隆抗体,为进一步研究以HSP65为基础的亚单位疫苗和核酸疫苗奠定了基础.
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重组金黄葡萄球菌肠毒素B及热休克蛋白65融合蛋白的原核表达及其在小鼠体内的体液免疫效果
目的 原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,rSEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白rSEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果.方法 采用分子生物学方法将修改过TCR Vβ结合区的rSEB基因与HSP65基因融合,构建重组表达质粒pET-28a-rSEB-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经铜柱亲和层析纯化.将纯化蛋白经小鼠背部皮下注射,分别于第0、14、28天各免疫1次,分别于第14、28、42 d经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-SEB的IgG水平.结果 重组表达质粒pET-28a-rSEB-HSP65经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确.表达的重组蛋白rSEB-HSP65的相对分子质量约85 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占全菌总蛋白的40.81％,纯化蛋白纯度约为90％.各组免疫小鼠均可产生较高滴度抗体,且在第14、28及42天大部分含铝佐剂疫苗组的效价显著高于相同剂量的无铝佐剂疫苗组(P＜0.05),第42天时无铝佐剂低剂量疫苗组与含铝佐剂低剂疫苗量组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白rSEB-HSP65,且可诱导小鼠产生较高的抗体水平.
关键词： 金黄葡萄球菌肠毒素B 热休克蛋白65 原核细胞 基因表达 体液免疫 -
抗βhCG多表位融合蛋白疫苗治疗实验小鼠黑色素瘤的机制研究
以融合蛋白HSP65-X10-βhCGCTP37作为免疫原,免疫荷瘤小鼠和未荷瘤小鼠,观察其对小鼠黑色素瘤B16-F10的体内治疗作用,以及其对肿瘤在体内的血管增生及肺转移的影响,并对其体内抗肿瘤的作用机理进行初步探讨.结果显示,HSP65-X10-βhCGCTP37的治疗对于小鼠黑色素瘤的攻击起到了有效的保护作用,与PBS对照组比较,实验组小鼠的平均瘤重显著降低(P＜0.05);有效抑制了肿瘤细胞的血管增生和肺转移;免疫后小鼠的血清中产生了特异性的高滴度抗体.说明HSP65-X10-βhCGCTP37蛋白疫苗能够激发小鼠的有效免疫应答、抑制黑色素瘤的血管增生和转移,从而抑制肿瘤的生长.
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热休克蛋白65与βhCG多表位融合蛋白疫苗的抗黑色素瘤研究
选取HSP65-X10-βhCGCTP37融合蛋白作为免疫原,观察其对小鼠黑色素瘤B16-F10的体内抑制作用,以及对荷瘤小鼠生存期的影响,并对其抗肿瘤的作用机理进行初步探讨.以制备的HSP65-X10-βhCGCTP37蛋白免疫C57BL/6J小鼠,2 w免疫1次,共4次.第4次免疫后的第2 w,进行肿瘤攻击实验.HSP65-X10-βhCGCTP37激发的免疫应答对于小鼠黑色素瘤的攻击起到了有效的保护作用,与PBS阴性对照组比较,实验组小鼠的平均肿瘤重量显著降低(P＜0.05);并有效延长了荷瘤鼠的生存期;小鼠的黑色素移植瘤的肿瘤病理切片结果显示,疫苗对肿瘤细胞的体内生长有明显的抑制作用,核分裂减少,淋巴细胞浸润增加,有灶性坏死.HSP65-X10-βhCGCTP37蛋白疫苗能有效地抑制小鼠黑色素瘤的生长.
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热休克蛋白65及其两个功能表位在调节动脉粥样硬化中的作用
动脉粥样硬化是一种自身免疫性疾病.人自身热休克蛋白60是主要的自身免疫原之一,能引起人自身免疫性反应进而促进动脉粥样硬化的发生,热休克蛋白65与人热休克蛋白60有较高的同源性,同源性为46%左右,具有相似的抗原表位,通过诱导粘膜免疫耐受产生抗炎效果将会对动脉粥样硬化产生积极的影响.热休克蛋白65鼻黏膜免疫动脉粥样硬化模型新西兰大白兔,能显著减轻主动脉粥样斑块,与PBS组存在极显著差异(P＜0.01).热休克蛋白65上31～46片段,180～188片段与霍乱毒素B亚单位的融合蛋白鼻黏膜免疫动脉粥样硬化模型新西兰大白兔,不能显著减轻主动脉粥样斑块,与PBS组不存在显著性差异(P＞0.05).结果表明HSP65鼻黏膜免疫新西兰大白兔能有效诱导兔黏膜免疫耐受,预防动脉粥样硬化;热休克蛋白65上31～46片段和180～188片段,虽然有文献报道通过诱导免疫耐受在小鼠自身免疫性疾病佐剂性关节炎中有很好的预防作用.但在动脉粥样硬化中却不能有效诱导黏膜免疫耐受而显著改善病情.
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热休克蛋白保守性B细胞表位黏膜免疫可增强免疫应答
目的:通过分枝杆菌热休克蛋白保守性B细胞表位多次免疫小鼠,研究热休克蛋白65(HSP65)与动脉粥样硬化之间的关系.方法:PCR技术扩增出HSP65上与动脉粥样硬化密切相关的6个B细胞表位基因.将这6个表位的基因分成两组,分别与CTB基因相融合并在大肠杆菌中表达.两种蛋白表达产物经过分离、纯化、混合复性,复性后的蛋白经GM1-ELISA证明可在体外自组装成5聚体.用复性后的重组蛋白小剂量多次滴鼻免疫ICR小鼠,然后用大量的HSP65蛋白经皮下免疫,采集血样,ELISA检测小鼠血清中抗HSP65的抗体.结果:重组蛋白预免疫ICR小鼠后,可以使免疫组较对照组对随后的大量HSP65刺激产生更加强烈的免疫反应.结论:分枝杆菌热休克蛋白保守性B细胞表位经鼻黏膜的反复预免疫强化了小鼠对随后攻击性免疫的反应.
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融合蛋白HSP65-6×P277在NOD鼠中降糖作用的机制研究
目的:探讨融合蛋白HSP65-6 ×P277在NOD鼠中的降糖作用机制.方法:融合蛋白HSP65-6 × P277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠.观察该融合蛋白对NOD小鼠血糖,细胞因子水平,抗体类型和胰腺炎严重程度的影响.结果:融合蛋白HSP65-6 × P277免疫组动物血清中含有高水平的IL-4和低水平的IL-2,P277特异性抗体类型主要为IgG1和IgG2b,IgG2a水平较低;T细胞增殖实验的培养上清中含有较高水平的IL-10和较低水平的IFN-γ;胰腺炎的严重程度和1型糖尿病的发病率显著降低.结论:诱导了Th2免疫反应可能是HSP65-6 × P277预防1型糖尿病发生的作用机制之一.
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鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277预防NOD小鼠1型糖尿病的发生
目的:提高多肽p277的免疫原性,从而提高其对自身免疫性糖尿病的预防作用.方法:将p277 6次重复与Hsp 65融合置于pET28a中构建重组Hsp 65-6×p277表达质粒.该重组质粒在大肠杆菌BL21中以高效可溶形式表达.依次通过细胞裂解、硫酸铵沉淀、双蒸水透析、DEAE纤维素52柱层析纯化获得目的蛋白.用纯化后的融合蛋白Hsp 65-6×p277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠.每月眼角取血,检测抗体和血糖浓度.结果:初步药效学实验表明融合蛋白Hsp 65-6×p277可抑制NOD小鼠中1型糖尿病的发生.结论:融合蛋白Hsp 65-6×p277有可能发展成为一种具有防治胰岛素依赖性糖尿病作用的疫苗.
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结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白稳定表达细胞系的建立
目的 构建了表达结核分枝杆菌Hsp65与IL-2融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的P815细胞系.方法 将Hsp65与IL-2基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1,转化DH5α菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒Hsp65-IL-2-pcDNA3.1.在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB/c遗传背景一致的P815(H-2d)细胞.G418筛选抗性克隆,免疫荧光检测融合蛋白的表达.结果 真核质粒转染的阳性克隆细胞,经RT-PCR检测到Hsp65与IL-2融合蛋白mRNA水平的表达,分别用抗Hsp65和IL-2的单抗进行间接免疫荧光检测,可在转染重组质粒的P815细胞膜上观察到较强的绿色荧光.结论 获得表达Hsp65与IL-2融合蛋白的稳定细胞系,为其CTL研究提供了合适的靶细胞.
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结核分枝杆菌HSP65与IL-2融合蛋白的表达和纯化
目的 获得融合表达的结核分枝杆菌热休克蛋白65与人白细胞介素2的重组蛋白,为进一步研究其对结核疫苗的作用奠定基础.方法 用PCR的方法分别从H37Rv DNA和质粒pGEM-Teasy-IL-2中扩增目的基因片段hsp65和IL-2,将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序,将测序正确的目的基因片段分别经EcoRⅠ和ClaⅠ,ClaⅠ和HindⅢ双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EX Hta,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,经IPTG诱导后进行融合表达,并通过镍柱对融合蛋白进行纯化.结果 PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致.构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE和Western-blot分析,在Mr 78000处有特异性的蛋白表达条带.用镍柱进行亲和层析纯化后得到了高纯度的HSP65-IL-2融合蛋白.结论 成功的构建了结核分枝杆菌HSP65与人IL-2的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,有望为结核的预防提供有效的疫苗.
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热休克蛋白65对视网膜毛细血管粥样硬化的影响
目的 探讨热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)对视网膜毛细血管粥样硬化的影响.方法 30只成年Wistar大鼠随机分为实验组(n=15)和对照组(n=15),实验组给予高脂高糖饮食建立视网膜毛细血管粥样硬化模型,对照组正常喂养,8周后测定两组大鼠血清与视网膜组织中HSP65表达情况,电子显微镜下观察视网膜毛细血管粥样硬化情况与斑块情况.结果 实验组的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇均高于对照组,血糖值也高于对照组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).实验组与对照组的血清中HSP65含量分别为(45.66±8.24) μmol·L-1和(20.67±9.44) μmol·L-1,实验组高于对照组(P＜0.05);实验组视网膜中的HSP65蛋白相对表达量为0.56±0.11,高于对照组的0.10±0.02,差异有统计学意义(P＜0.05).对照组视网膜毛细血管内皮细胞层和弹力板均完整且贴附紧密;实验组视网膜毛细血管内膜有程度不等的增厚,管腔呈偏心性狭窄,内膜中细胞外基质增多.实验组视网膜毛细血管的血管面积、斑块面积与斑块比例均高于对照组,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 HSP65在视网膜毛细血管粥样硬化大鼠的血清与视网膜组织中均呈高表达,可导致视网膜毛细血管的血管面积、斑块面积与斑块比例增加.
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人热休克蛋白65检测在冠心病中的应用价值
目的:探讨入院即刻人热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)检测在反映冠心病病情程度中的作用,并分析其与冠心病其他危险因素之间的关系.方法:入选89例研究对象,分为急性冠状动脉综合征(ACS)组、稳定型心绞痛组、无冠心病组.所有患者均行冠状动脉造影术明确病变程度.记录所有患者的一般临床资料.应用ELISA方法测定血清中人HSP65含量.结果:ACS组中人HSP65的含量为(2 228.63±616.56)ng/L,较稳定型心绞痛组(1 891.89±182.91)ng/L及无冠心病组(1 773.65±157.21)ng/L均明显增高(P<0.05),稳定型心绞痛组人HSP65含量比无冠心病组亦明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05).人HSP65含量与入院即刻血糖、脑钠肽、肌酸激酶同工酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、Gensini积分呈正相关关系(P<0.05),与左室射血分数呈负相关关系(P<0.05).人HSP65与冠心病已确立的其他危险因素均无关(P>0.05),Logistic回归分析显示人HSP65是ACS的一个独立危险因素(P=0.001).结论:人HSP65检测在冠心病中具有重要的应用价值,人HSP65是ACS的独立危险因素,可以作为反映病情的一个重要的实验室指标.
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结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定
目的:构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65 kU基因为基础的核酸疫苗.方法:采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-) 的相应酶切位点,并将此重组质粒进行序列测定.结果:重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65.结论 :以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础.
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结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达
目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体,为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础.方法采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因,经相应限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1/His,并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞,用SDSPAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性.结果获得正向插入的pcDNA3.1/His-HSP65-G2重组表达质粒,表达产物的相对分子量为105 kD,与理论预期大小一致,并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应.表明构建的pcDNA3.1/His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性.结论编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功.
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人结核杆菌热休克蛋白65重组卡介苗疫苗的构建、表达及鉴定
目的构建人结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)重组卡介苗(BCG)疫苗.方法用PCR技术从BCG基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽DNA序列,从pCMV-MTHSP 65质粒中扩增出HSP65全长基因.利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG-2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建一个分泌型的原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65.利用电穿孔的方法将该质粒转入BCG中,经热诱导后,用SDS-PAG电泳来观察其表达水平.利用Western blot来检验HSP65的生物学活性.结果酶切鉴定、PCR和测序分析结果表明,所克隆的信号肽DNA片段和热休克蛋白65 DNA片段与报道结果完全一致,重组体的连接方向正确,阅读框与预期完全一致.热诱导后,重组BCG表达的65 kD(1 kD=0.992 1 ku)蛋白占菌体总蛋白的35.67 %,占裂解物上清总蛋白的74.09 %,表明重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在.通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合.结论成功构建分泌型原核穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65,重组的HSP65基因能在BCG中高效表达,表达的HSP65具有生物学活性,重组BCG疫苗构建成功.
关键词： 信号肽 人结核杆菌 热休克蛋白65 分泌型原核穿梭表达质粒 重组卡介苗 -
人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达
目的 构建人结核杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A, 并检测其在体外的表达.方法 利用聚合酶链反应(PCR)法及基因重组技术, 以人结核杆菌基因组DNA为模板, 扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A.将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达.结果 经过测序证实重组质粒构建成功, 该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA.结论 成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A, 该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达.
