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大鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达与培养条件优化
目的:利用毕赤酵母表达系统,表达大鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidase B,proCPB)蛋白,同时探讨优表达条件,为规模化发酵生产羧肽酶B奠定基础.方法:以RT-PCR法从SD大鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,转入毕赤酵母Gs115细胞,在甲醇的诱导下表达目的蛋白.结果与结论:首次实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达;通过表达条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%(体积比体积)的酪蛋白水解物和3 mmol/L的PMSF,于28℃,每隔12 h补加0.5%(体积比体积)的甲醇,重组酵母Gs115-proCPB表达的重组蛋白可达500 mg/L,表达的目的蛋白占总蛋白的94%,活化后的重组CPB相对分子质量为35.1×10 3,与理论值(35.2×10 3)极相近.活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110 U/mg(CPB参照品为180 U/mg).
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尿羧肽酶B激活肽在重症急性胰腺炎中的临床应用价值
重症急性胰腺炎Severe Acute Pancreatitis,SAP)是普外科中的一种常见病.其发病急,临床表现复杂,病程进展迅速,极易引起多脏器功能损害,病死率高达20%,因此快速准确诊断SAP并及早治疗十分重要.
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重组羧肽酶原B的复性及纯化
目的建立重组羧肽酶原B复性方法及活性羧肽酶B的纯化方法.方法重组大肠杆菌发酵后,表达的羧肽酶原B包涵体经洗涤、变性,采用凝胶过滤的方法对其进行复性及纯化.所得的复性液经Trypsin酶解后,采用DEAE-FF阴离子交换层析进行羧肽酶B的分离纯化,并采用SDS-PAGE检测纯度.结果经凝胶过滤后得到了复性和纯化的羧肽酶原B包涵体,在蛋白终浓度相同的情况下,复性效率比稀释复性提高了50%,经DEAE离子交换柱一步纯化,得到了活性羧肽酶B,纯度达到90%以上.以Hippuryl-L-arg为底物测活,得到的活性酶的比活为150 u/mg.结论所建立复性方法及纯化方法为进一步的研究奠定了基础.
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重组羧肽酶原B在大肠杆菌中的可溶性表达及活性羧肽酶B的纯化
实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化,得到活性CPB.采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达;优化酶解激活条件,提高粗酶液比活.粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octy卜FF疏水柱两步纯化.结果:实现可溶性表达的佳条件为15℃下,0.1 mmol/LIPTG诱导20 h.此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化,得到比活为128.2 u/mg protein的较纯的活性CPB,活性回收率达39%.
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羧肽酶B研究进展
羧肽酶B是重组胰岛素生产中的一个必需工具酶,同时在蛋白质测序等领域中也得到广泛应用.文章综述了羧肽酶B的结构、测活方法、性质、稳定性及储存条件、提取方法、基因工程方法生产羧肽酶B的研究及重组羧肽酶B的性质等.
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猪胰腺羧肽酶B提取工艺中的激活条件与稳定性研究
目的 研究猪胰腺羧肽酶B提取工艺中的激活条件以及激活后粗酶液的稳定性,并对酶进行纯化.方法 胰腺匀浆、激活,硫酸铵盐析进行初步提取,采用疏水色谱、离子交换色谱和分子筛等方法进行纯化,对胰腺匀浆后的粗酶激活条件进行了研究,考察了不同保存条件下粗酶液的稳定性.结果 纯化后的羧肽酶B经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯.比活为152 u/mg,纯化过程的活性总回收率为51%.粗酶液中羧肽酶B的激活受各种条件影响,特别是激活温度和激活时间,4℃下激活80 h,或37℃下,激活6.5 h, 均可获得大酶活,激活后的粗酶液可直接于35%(NH4)2SO4中保存,保存60 h的酶活损失小于5%.结论 通过调整激活温度与激活时间可以获得猪胰腺羧肽酶B粗酶液大的激活效果,激活后的粗酶液可于35%(NH4)2SO4中短期保存.
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不同pH值下尿素浓度对羧肽酶B活力的影响
目的 比较不同pH值下尿素浓度对羧肽酶B活力的影响.方法 分别检测在pH 7.65,9.0,10.0和尿素浓度为0,1,2,3 mol/L时的羧肽酶B活性.结果 尿素浓度在3 mol/L时,其活力降低至正常活性的30%左右;pH 10.0时,其活力降低至正常活性的60%左右.结论 尿素浓度增加比pH值升高对羧肽酶B活力影响大.
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羧肽酶B的稳定性考察
目的对羧肽酶B (CPB) 进行稳定性考察.方法将同批比活为200 u/mg 的 CPB分别以0、0.05、0.1、0.2、0.3、1 mol/L NaCl溶液及(NH4)2S04 65%饱和度盐析形式保存,定期检测CPB活力.选择出相对稳定盐浓度条件,另分别以4℃、-20℃、冻融状态保存,定期检测CPB活力.结果以0.1 mol/L NaCl溶液在-20℃冻存CPB为适条件.结论温度及盐浓度是影响CPB活力下降的主要因素.
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诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究
目的 研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系.方法 在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性.结果 诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同.复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高.结论 诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率.
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诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率影响的研究
目的 研究诱导时机对羧肽酶原B包涵体质量和复性率的影响,探讨包涵体质量评价体系.方法 在不同时间诱导产生重组羧肽酶原B包涵体,研究其变性和复性、对蛋白酶K的稳定性及在一定浓度盐酸胍溶液中的化学变性,分析诱导时间与包涵体复性率的相关性.结果 诱导时机不同,所得重组羧肽酶原B包涵体复性率及对蛋白酶K的稳定性不同,在一定浓度盐酸胍溶液中的溶解性也不同.复性率越高的包涵体越不易被蛋白酶K酶解,对化学变性剂的稳定性也高.结论 诱导时机影响重组羧肽酶原B包涵体的质量及复性率.
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血清hs-CRP、FIB联合尿CAPAP诊断急性重症胰腺炎的临床价值分析
目的 探讨血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)、纤维蛋白原(FIB)联合尿液羧肽酶B激活肽(CA-PAP)诊断急性重症胰腺炎(SAP)的临床价值.方法 选取2016年3月至2017年12月该院收治的确诊为急性胰腺炎患者67例作为研究对象,其中SAP 29例,急性轻症胰腺炎(MAP)38例.选择同期在该院进行健康体检者40例作为对照组.检测并比较急性胰腺炎患者入院时,入院后24、48、72 h时,以及健康体检者血清hs-CRP、FIB和尿CAPAP水平.计算和评价各项指标单独及联合检测的诊断效能.结果 随入院时间的延长,SAP、MAP患者血清hs-CRP、FIB均显著升高,且显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);SAP、MAP患者各时间点尿CAPAP阳性率显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);SAP患者不同时间点血清hs-CRP、FIB水平及尿CPAPA阳性率均显著高于M AP患者,差异均有统计学意义(P<0.05).尿CA-PAP对急性重症胰腺炎的诊断效能高,其次为血清hs-CRP,再次为血清FIB;3项指标联合检测诊断SAP的灵敏度为90.3％,准确度为94.3％,特异性为92.6％,阳性预测值为90.3％,阴性预测值为92.6％;3项指标联合检测的诊断效能均显著高于任一单项指标检测,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 血清hs-CRP、血清FIB、尿CAPAP水平均可作为诊断SAP的监测指标,三者联合检测比任一单项指标检测更有助于早期诊断SAP,对病情严重程度的判断 、治疗和预后评价具有重要临床价值.
