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Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响
目的 构建表达人白血病抑制因子(LIF)和抑瘤素M(OSM)双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞,并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34+.造血干/祖细胞体外增殖和分化的影响.方法 以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ为基础,将OSM基因片段酶切后插入,构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ -OSM.将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-OSM,通过包装,收获重组腺病毒(AdLIF-OSM).将重组腺病毒感染饲养层细胞,经RT-PCR、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达；体外与CD34+造血干/祖细胞共培养后,通过Transwell法和细胞计数检测,比较各实验组干/祖细胞体外扩增与分化情况.结果 测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确；转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达；外源LIF和OSM基因在造血干/祖细胞体外培养中能够发挥作用.结论 成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体(Ad-LIF-OSM),Ad-LIF-OSM在造血干/祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.
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用细胞因子流式细胞计数术体外检测重组人IL-12的生物学活性
对重组IL-12生物学活性的鉴定目前国内外多采用淋巴细胞增生试验(MTT)、NK细胞杀伤试验(LDH)、IFN-γ产生等方法.细胞因子流式细胞(cytokine follow cytometry,CFC)是近年来体外细胞免疫功能研究中出现的新方法[1],不仅简单、快速,而且可以同时获得针对某种抗原特异性T细胞亚群数量及其功能的二维指标.本研究构建了人IL-12单链双亚基共表达载体,在HEK293细胞中表达重组IL12.分别应用CFC、MTT、LDH等方法对其生物学活性进行鉴定.
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人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒
背景:一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体,可提高转染和表达效率.目的:利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin,MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列,构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony sfimulating factor,GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+).MUCI-GM-CSF,并观察重组质粒存COS-7细胞中的表达.设计、时间及地点:基因重组体设计实验,于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成.材料:真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou 教授惠赠.pGEM.3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E.coli DH5 α为自备,雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法:将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF.以重组质粒转染COS-7细胞.主要观察指标:通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达.结果:酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产牛抗GM-CSF抗体.结论:成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒.
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人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达
目的 构建人结核杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A, 并检测其在体外的表达.方法 利用聚合酶链反应(PCR)法及基因重组技术, 以人结核杆菌基因组DNA为模板, 扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A.将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达.结果 经过测序证实重组质粒构建成功, 该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA.结论 成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A, 该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达.
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结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达
目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.
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miR-9和miR-124共表达载体的构建与靶分子鉴定
目的 构建miR-9和miR-124单独表达和串联共表达的真核表达载体,并鉴定其共同靶分子.方法 将pri-miR-9和pri-miR-124的编码序列分别插入或串联后插入真核表达载体pCAG,转染HeLa细胞后,实时定量PCR鉴定成熟miRNA的表达水平.构建miR-9和miR-124分子完全互补的靶基因萤光素酶报告载体,双萤光素酶报告系统检测表达的成熟miRNA的生物学功能.利用生物信息学软件预测miR-9和miR-124的共同靶分子,将靶分子mRNA的3 '非翻译区(UTR)克隆入pGL3luciferase报告基因载体中,观察转染细胞后miRNA对报告基因表达的影响.结果 经测序及酶切鉴定证实3种miRNA表达载体构建完全正确,实时定量PCR检测表明这3种表达载体均能正确高表达成熟的miRNA.双萤光素酶报告系统检测证实3种载体表达的miRNA分子具有生物学活性.生物学软件预测发现小分子GTP结合蛋白Ras相关蛋白2a(Rap2a)是miR-9和miR-124的靶基因,成功构建了含有Rap2a 3'UTR的萤光素酶报告基因载体.双萤光素酶报告系统提示miR-9和miR-124均能抑制Rap2a的表达.结论 成功构建了miR-9和miR-124的单独表达和共表达载体,并能高表达具有生物学活性的成熟的miR-9和miR-124分子.Rap2a可能是miR-9和miR-124的一个共同靶分子.
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人MUC1与GM-CSF基因融合真核表达质粒的构建与表达
目的:构建人MUC1重复序列串联体基因与GM-CSF 基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF, 并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达.方法:将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后, 与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF.以重组质粒转染COS-7细胞, 通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达.结果:酶切鉴定及序列分析表明, 重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF 的融合基因, 在COS-7细胞中可检测到MUC1表达, 重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体.结论:人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建, 为对其免疫原性、生物学特性及免疫治疗的进一步研究奠定了基础.
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结核分枝杆菌Ag85B与IL-12基因真核共表达质粒的构建及表达
目的: 构建结核分枝杆菌Ag85B和鼠IL-12基因的共表达载体pBud85B-IL12.方法: 将结核分枝杆菌Ag85B基因和鼠IL-12基因同时克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中, 构建真核共表达质粒pBud85B-IL12.以pBud85B-IL12转染COS-7细胞, 通过RT-PCR及ELISA方法检测目的基因的表达.结果: 在COS-7细胞中同时可检测到Ag85B和IL12的表达.结论: pBud85B-IL12共表达质粒的成功构建, 为对其免疫原性、免疫反应性及免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
