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E2F-1与小细胞肺癌多药耐药及预后的相关性
目的 探讨E2F-1在小细胞肺癌(SCLC)多药耐药中的作用及其与预后的关系.方法 检测92例SCLC患者肿瘤组织中E2F-1的表达,分析E2F-1 mRNA表达对患者生存时间的影响,培养人SCLC敏感细胞株H69和多药耐药细胞株H69AR,分为E2F-1过表达组、阴性对照组和空白对照组,检测不同转染组细胞药物敏感性.结果 SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量与癌旁组织比较,差异有统计学意义(P<0.05);低表达组患者中位生存时间与高表达组比较,差异有统计学意义(P<0.05);E2F-1过表达组H69细胞对阿霉素、顺铂和依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而E2F-1干扰组H69AR细胞对阿霉素、顺铂及依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 E2F-1在SCLC组织中呈高表达,下调E2F-1可增强多药耐药细胞株H69AR对化疗药物敏感性.
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E2F-1过表达对胃癌细胞凋亡及相关基因表达的影响
背景与目的:E2F-1(E2F transcription factor 1)基因是细胞周期的重要转录因子,也参与了细胞凋亡的过程,但机制尚不明确.本研究通过观察E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803凋亡的影响及对下游基因的调控,初步探讨其参与凋亡的分子机理.方法:用流式细胞仪检测稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞的凋亡情况.再分别抽取MGC-803/E2F-1和MGC-803细胞的总RNA,采用逆转录的方法,制成cDNA,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针(荧光交换芯片),与含有21 522条人类基因表达谱芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析与凋亡相关的基因的表达,再用RT-PCR针对性的对筛选得到的基因进行验证.结果:MGC-803/E2F-1组细胞的凋亡率明显高于MGC-803/EV组和MGC-803组,3组凋亡率分别为(8.40±0.91)%、(4.53±0.61)%、(4.97±0.47)%;基因芯片扫描筛选出与凋亡相关的差异表达基因15条,其中上调基因4条,下调基因11条;RT-PCR验证多条相关基因其上、下调趋势同基因芯片结果一致.结论:E2F-1基因过表达促进了胃癌MGC-803细胞的凋亡,其影响机制可能与这15条差异表达基因有关系.
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转录因子E2F-1 siRNA对胃癌MGC803细胞体外侵袭及增殖能力的影响
背景与目的:转录因子E2F-1作为细胞周期进程中重要的调控因子,与肿瘤的发生有着密切的关系.本研究通过转染人E2F-1基因的小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中E2F-1表达及侵袭和增殖能力的影响.方法:用脂质体LipofectamineTM 2000将具有短发夹结构的人E2F-1 siRNA表达质粒转染至MGC803细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)技术分别检测E2F-1 mRNA及蛋白的表达;应用体外侵袭实验及克隆实验分别检测E2F-1 siRNA表达质粒对MGC803细胞侵袭力和增殖能力的影响.结果:成功转染E2F-1 siRNA表达质粒48 h后.MGC803细胞中E2F-1基凶mRNA表达的抑制率超过90%;与未转染组及阴性对照组细胞比较,E2F-1蛋白的表达分别降低81.5%和79.6%.转染pSilencer4.1-E2F-1质粒组的穿膜细胞数(18.0±2.6)与阴性对照组(48.0±4.6)和空白对照组(54.0±5.6)比较差异有统计学意义(P<0.05),其细胞集落形成数(46.0±2.0)与阴性对照组(122.3±1.5)和空白对照组(128.7±2.1)比较差异也有统计学意义(P<0.05).结论:E2F-1 siRNA表达质粒可显著下调E2F-1基因在胃癌MGC803细胞中的表达,在一定程度上抑制胃癌细胞的侵袭和增殖.
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E2F-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株MKN-45增殖的影响
背景与目的:E2F-1基因在多种肿瘤细胞中过表达,并表现出抑制或促进肿瘤细胞增殖的不同特性.本研究通过构建E2F-1基因真核表达载体.分析E2F-1过表达对胃腺癌细胞株MKN-45的影响.方法:巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增E2F-1基因片段,用pCMV-HA载体构建真核重组质粒,转染MKN-45细胞(转染COS-7细胞用以鉴定所构建的载体).Western blot检测转染情况.并通过克隆形成实验、MTS法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期,观察E2F-1过表达对MKN-45细胞的影响.结果:pCMV-E2F1-HA重组质粒成功转染MKN-45细胞.转染pCMV-E2F1-HA的MKN-45细胞形成的克隆数为4.7±1.8,明显少于转染空载体组的30.2+6.7(P＜0.01).转染pCMV-E2F1-HA的MKN-45细胞增殖随时间而减慢,第5、6、7天的细胞增殖率分别为73.5%、63.5%和56.1%,明显低于转染空载体组(P＜0.01).与转染空载体组相比,表达E2F-1基因的MKN-45细胞在G0/G1期所占比例明显提高(71.4% vs.59.7%,P＜0.05),S期所占比例明显下降(18.7% vs.30.7%,P＜0.05).结论:成功构建E2F-1基因真核表达载体,E2F-1过表达可抑制MKN-45细胞的增殖.
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E2F-1基因沉默可增强人胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP对顺铂的敏感性
目的：探讨E2F转录因子1（E2F transcription factor 1, E2F-1）基因沉默对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP对顺铂敏感性的影响及可能机制。方法将SGC-7901/DDP细胞接种于六孔板，分为3组：以E2F-1沉默重组慢病毒颗粒（Lv-shRNA-E2F-1）感染SGC-7901/DDP，作为Lv-shRNA-E2F-1组；以阴性对照慢病毒颗粒（Lv-shRNA-NC）感染SGC-7901/DDP，作为Lv-shRNA-NC组；空白对照组不做任何处理。以MTT法测定转染后各组细胞对DDP的半数抑制浓度（IC50），并以AxnnexinV-PE/7-AAD双染色流式细胞术检测各组细胞凋亡率及周期分布。应用Western blot和半定量RT-PCR技术分别对各组细胞中E2F-1、survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白水平进行检测。结果与Lv-shRNA-NC组和空白对照组相比，Lv-shRNA-E2F-1组细胞对顺铂的IC50显著降低，细胞凋亡率显著提高，细胞周期阻滞于G0/G1期，差别均有统计学意义（P<0.05）；Lv-shRNA-E2F-1组E2F-1 mRNA水平较Lv-shRNA-NC组和空白对照组分别下降45.0%和41.3%，蛋白水平分别下降66.7%和70.5%（均P<0.01）；Lv-shRNA-E2F-1组survivin mRNA水平较Lv-shRNA-NC组和空白对照组分别下降30.3%和28.7%，蛋白水平分别下降56.5%和53.6%（均P<0.01）；Lv-shRNA-E2F-1组Bcl-2 mRNA水平较Lv-shRNA-NC组和空白对照组分别下降76.6%和76.8%，蛋白水平分别下降74.6%和79.9%（均P<0.01）；Lv-shRNA-NC组与空白对照组比较，上述指标差别均无统计学意义（均P>0.05）。结论：沉默E2F-1基因可有效提高人胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP对顺铂的敏感性，其机制可能与survivin及Bcl-2表达下调有关，提示E2F-1可能成为胃癌药物治疗的新靶点。
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E2F-1在肝癌中的表达及对预后的影响
目的 探讨E2F-1在肝细胞癌中的表达情况及其对患者预后的影响.方法 收集接受肝癌根治术患者的术后标本,采用免疫组织化学S-P法检测159例肝癌组织及癌旁肝组织中E2F-1蛋白的表达情况,并分析E2F-1表达与临床病理特征的关系及其对患者总体生存率和无瘤生存率的影响.结果 E2F-1主要在肿瘤组织细胞核中表达,阳性率为56.0％,癌旁肝组织无表达,肝癌组织中E2F-1阳性表达率显著高于癌旁组织(P ＜0.01);E2F-1表达与甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小及肿瘤分化程度有关(P＜0.05).E2F-1阳性表达与阴性表达组的1、3、5年总体生存率分别为61.4％、54.4％、50.4％及47.8％、36.2％、22.7％ (P =0.022);相应的1、3、5年无瘤生存率分别为59.4％、31.7％、28.6％及41.4％、13.7％、13.7％ (P =0.003).结论 E2F-1在肝癌组织中高表达,其表达水平与AFP、肿瘤分化程度及肿瘤大小有关,E2F-1的低表达是肝癌根治性切除术后的总体生存率和无瘤生存率的独立预后因素,可能发挥抑癌基因功能,可作为肝癌术后的预后预测因子.
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E2F-1过表达对胃癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨E2F-1对胃癌细胞生物学行为影响的分子机制.方法 分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA.纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出表达差异的基因.随机选取3个差异表达基因,分别设计引物,用半定量RT-PCR检测验证.结果 在21 522条基因中,两组细胞间的差异表达基因有740条,其中上调基因405条,下调基因335条.差异基因中有73条功能信息不明.随机选取的3个差异表达基因的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性.结论 胃癌的发生发展是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果.生物信息学分析显示,E2F-1基因可以通过TP53信号传导途径影响胃癌MGC-803细胞生物学行为的改变,还与众多基因的差异性表达密切相关.
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E2F-1与p16在宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌中的表达及临床意义
目的 研究细胞周期调控因子E2F-1和p16蛋白与宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌的表达及其临床意义.方法 通过免疫组化SP法检测宫颈上皮内瘤变Ⅰ-Ⅱ级(CIN Ⅰ-Ⅱ级)、宫颈上皮内瘤变Ⅲ级(CINⅢ级)、宫颈鳞癌各40例中E2F-1和p16蛋白的表达情况,并用20例慢性宫颈炎组织作对照.结果 E2F-1蛋白在CIN Ⅰ-Ⅱ级、CINⅢ级和宫颈鳞癌组中阳性率分别为17.5％、67.5％和80.0％,3组间有差异(x2=37.278,P＜0.001).p16蛋白表达阳性率分别为27.5％、70.0％和82.5％,3组间差异有统计学意义(x2=27.708,P＜0.001).CIN Ⅰ-Ⅱ级与CINⅢ级组及宫颈鳞癌组比较均有差异,但CINⅢ级与宫颈鳞癌组间无差异.p16蛋白的表达与E2F-1蛋白表达有正相关关系;在鳞癌组中E2F-1与p16的异常表达与组织学分级、临床分期有关(P＜0.05).结论子宫颈鳞癌的形成与E2F-1、p16蛋白过表达是呈正相关关系,E2F-1、p16蛋白可能作为子宫颈鳞癌及CIN的标志物,对子宫颈癌筛查和预防有重要意义.
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系膜增生性肾炎肾组织E2F-1的表达及临床意义
目的: 探讨核转录因子-1(E2F-1)在系膜增生性肾炎(MsPGN)肾组织中的表达及其与肾固有细胞增生和临床的关系.方法: 采用免疫组织化学法检测36例MsPGN患者(MsPGN组)肾活检组织E2F-1的表达,并将其与临床作相关性分析.肾外伤切除的正常肾组织6例作为正常对照组.结果: 正常对照组肾小球未见E2F-1表达,肾小管间质见少许表达.MsPGN组肾小球和肾小管间质均有E2F-1表达,两组比较,具有显著统计学差异(P<0.01),轻、中、重度系膜增生组随系膜增生加剧E2F-1表达逐渐增强(P<0.05或P<0.01).肾小球、肾小管间质E2F-1表达与未使用类固醇激素/免疫抑制剂、未使用血管紧张素转移酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素受体拮抗剂(ARB)呈正相关;肾小球E2F-1表达与BP、24 h尿蛋白(TMP)水平呈正相关,与内生肌酐清除率(Ccr)呈负相关;肾小管间质E2F-1表达与临床无相关性.肾小球与肾小管间质E2F-1表达无相关性.结论: E2F-1表达水平可反映MsPGN患者系膜细胞及小管间质的增生程度,也可间接反映BP、TMP及肾功能水平,药物可干预E2F-1的表达.
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siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响
目的 应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响.方法 将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1 mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法(Western blot)检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况.采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异.结果 重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%(P<0.05)和66.60%(P<0.05),差异有统计学意义.结论 沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生.
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E2F-1过表达对胃癌细胞中癌基因和抑癌基因表达的影响
目的:了解E2F-1过表达对胃癌细胞中癌基因和抑癌基因表达的影响,探讨E2F-1影响胃癌细胞侵袭能力的作用机制.方法:从胃癌细胞MGC-803和MGC-803/ E2F-1中提取总RNA,纯化mRNA,逆转录将Cy3和Cy5两种荧光素标记到两组逆转录合成的第一链cDNA.与22K人类基因组寡核苷酸芯片进行杂交,采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对图像处理分析,筛选出差异基因.结果:在21 522条基因中,MGC-803/E2F-1和MGC-803细胞差异表达的癌基因和抑癌基因有39条,其中上调基因19条(49%),下调基因20条(51%).结论:过表达E2F-1在胃癌细胞MGC-803中影响了众多癌基因和抑癌基因的表达变化,表明胃癌侵袭能力的变化是多基因相互作用,多种信号传导途径相互影响的结果.
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转录因子E2F-1 siRNA表达质粒的构建及对胃癌MGC803细胞的沉默效应
目的:通过构建人E2F-1基因的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中E2F-1基因表达的影响.方法:将设计合成的具有短发夹结构的人E2F-1基因siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接人经BamH I和Hind Ⅲ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo表达质粒,并做酶切及测序鉴定.用脂质体把重组质粒转染至细胞,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)及蛋白印迹(western blotting)技术分别检测E2F-I mRNA及蛋白表达.结果:经酶切及测序鉴定,成功构建了E2F-l siRNA表达质粒;它可显著抑制MGC803细胞中E2F-1基因mRNA及蛋白表达,与未转染组及阴性对照组细胞比较,分别降低了86.4%、86.1%和81,5%、79.6%.结论:pSilencer4.1一E2F-l重组质粒能抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1基因的表达,为进一步E2F-1基因的功能研究及胃癌治疗研究提供了实验基础.
关键词： RNA干扰 胃癌MGC803细胞 E2F-1 重组表达质粒 -
转录因子E2F-1 mRNA在胃癌中的定量表达及临床意义
目的:探讨转录因子E2F-1 mRNA在胃癌组织中的表达及临床意义.方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测E2F-1 mRNA在胃癌组、癌旁组和正常对照组中的表达情况,并联系.临床病理特征进行分析.结果:胃癌组中E2F-1 mRNA的阳性表达率为72.4%(42/58),癌旁组为50.0%(29/58),正常对照组为27.9%(12/43),组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E2F-1 mRNA在不同的临床分期、病理类型和有无淋巴结转移之间阳性表达率大致接近,差异无统计学意义(P>0.05).结论:E2F-1 mRNA在胃癌组织中具有较高的表达量,其转录表达量与各类临床病理特征之间没有必然联系,提示E2F-1 tuRNA的高表达可能与胃癌的发生有关.
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转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建细胞周期相关转录因子E2F-1 RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体.方法:选取E2F-1基因的19 nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox 3.7(pLL 3.7)慢病毒表达载体中,Xba I和 Not I进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48 h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度.结果:双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×107 TU/mL.结论:成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体.
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子宫内膜癌中MDM2和E2F-1的表达及与恶性程度的相关性
目的 临床检测MDM2和E2F-1在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中表达情况,探讨MDM2在子宫内膜癌组织中存在及临床意义.方法 采用传统的免疫组织化学S-P法检测子宫内膜癌、正常子宫内膜组织中MDM2和E2F-1的表达情况并进行统计学分析.结果 子宫内膜癌组织中MDM2和E2F-1表达定位于细胞核,其阳性表达率分别为73.33％ (66/90)和56.67％(51/90),明显高于正常子宫内膜组织8.33％(3/36)和2.78％(1/36) (P＜ 0.05);在不同组织分级、不同病理分期、是否有淋巴道转移及不同浸润深度的子宫内膜癌中MDM2和E2F-1的表达差异均有统计学意义(P＜0.05),而在不同组织学类型子宫内膜癌中两者的表达差异均无统计学意义(P＞0.05).在子宫内膜癌组织中MDM2和E2F-1表达呈明显正相关性.结论 MDM2和E2F-1在子宫内膜癌表达水平较高,可以反应出子宫内膜癌的恶性程度,并且免疫组织化学方法已经普及临床,检测方法简便、易用,为临床对子宫内膜癌预后判断具有一定的指导意义.
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子宫内膜癌中E2F-1和Survivin的表达及相关性
目的 检测子宫内膜癌组织中E2F-1和Survivin表达情况并探讨其意义. 方法 采用免疫组织化学S-P法检测60例子宫内膜癌、32例正常子宫内膜组织中两者的表达. 结果 子宫内膜癌组织中E2F-1和Survivin表达定位于细胞核,其阳性表达率分别为58.33％(35/60)和55.00％(33/60),均明显高于正常子宫内膜组织0和0(P＜0.05).两者的表达与有无淋巴结转移、浸润深度、临床分期及病理分期有关(P＜0.05)；通过相关性分析E2F-1和Survivin在子宫内膜癌组织中呈正相关(P＜0.05). 结论 E2F-1和Survivin在子宫内膜癌呈成过度表达,两者共同作用参与子宫内膜癌的发生、发展及转移.
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大肠癌中核转录因子E2F-1及细胞周期因子D1的表达及意义
目的 探讨E2F-1和cyclinD1在大肠腺癌组织中的表达及意义.方法 采用免疫组化SP法检测78例大肠腺癌、20例正常大肠黏膜、30例大肠息肉以及30例大肠腺瘤E2F-1和cyclinD1的表达情况.结果 E2F-1和cyclinD1在大肠腺癌中的阳性率显著高于正常大肠黏膜、大肠患肉以及大肠腺瘤(P＜0.05).E2F-1和cyclinD1表达与大肠腺癌的病理分化程度、淋巴结转移和临床分期具有相关性(P＜0.05).结论 E2F-1和cyclinD1的表达与大肠腺癌发生关系密切,是大肠腺癌发生、发展的重要生物学标记物.
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应用基因芯片研究E2F-1过表达对胃癌细胞免疫相关基因表达的影响
目的 利用基因表达谱芯片技术筛选过表达E2F-1的胃癌MGC-803细胞与对照组间差异表达的免疫相关基因,初步探讨E2F-1对胃癌细胞免疫功能影响的机制.方法 分别抽取转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞和未转染E2F-1的胃癌MGC-803细胞的总RNA.纯化mRNA,逆转录合成cDNA标记后,与22K人类基因表达谱芯片进行杂交,扫描后筛选出与免疫相关的差异表达基因,半定量RT-PCR方法验证差异表达基因. 结果 在21 522条基因中,两组细胞间差异表达的免疫相关基因有10条,其中上调基因2条,下调基因8条.上调基因中有1条功能信息不明.其中myc的RT-PCR结果与基因芯片扫描结果相似,具有相同的方向性.结论 利用基因芯片技术筛选出E2F-1过表达影响胃癌细胞免疫功能的相关基因,为今后更深入的研究E2F-1对胃癌免疫功能的影响奠定了基础.
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E2F-1和CyclinD 1在子宫内膜癌中的表达及相关性分析
目的 探讨子宫内膜癌组织中E2F-1和CyclinD1表达情况及其意义.方法 采用免疫组织化学S-P法检测60例子宫内膜癌、32例正常子宫内膜组织中两者的表达.结果 子宫内膜癌组织中E2F-1和CyclinD1表达定位于细胞核,其阳性表达率分别为58.33％(35/60例)和60.00％(36/60例),明显高于正常子宫内膜组织(P＜0.05).两者的表达与肌层浸润程度、淋巴结转移、临床分期及病理分期有关(P＜0.05);在子宫内膜癌组织中E2F-1和CyclinD1两者之间比较表达呈正相关(P＜0.05).结论 E2F-1和CyclinD1在子宫内膜癌患者呈高表达,且与子宫内膜癌的发生、发展和转移密切相关.
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转录因子E2F-1与人类肿瘤
核转录因子E2F-1在细胞周期调控,细胞凋亡和肿瘤发生中具有重要作用.近年来,研究表明E2F-1在人类肿瘤的发生发展中既能作为癌基因又能作为抑癌基因起作用.本文将就E2F-1与肿瘤的关系进行综述.
