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大鼠骨髓间充质干细胞与PLGA构建组织工程脂肪的实验研究
目的 探讨采用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)生物支架及骨髓间充质干细胞,构建组织工程化脂肪组织的可行性.方法 将雄性大鼠骨髓间充质干细胞接种于PLGA支架上,成脂诱导培养1周,扫描电镜观察细胞在支架上的生长及黏附情况;同时,将细胞-支架复合体异体移植于雌性大鼠体内,观察其成脂情况,并使用原位杂交技术鉴定.结果 在生物支架上大量成脂细胞呈簇状生长;1个月时可见脂肪组织形成,3个月时脂肪组织成熟.结论 PLGA生物支架是一种理想的生物可降解支架,骨髓间充质干细胞接种于PLGA生物支架可用于组织工程化脂肪的研究.
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适宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:佳孔径筛选
背景:既往组织工程脂肪的研究中,支架材料的孔径往往被忽略.如孔径过大,细胞会顺着过大的孔隙流走,难以保留在支架中;孔径过小,细胞则主要分布于支架材料的表面,不易进入支架中,同时也不利于新生血管生长.目的:筛选用于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的适宜孔径.方法:在保持蚕丝蛋白浓度不变条件下,通过改变冷冻干燥温度与时间,制备出6批次不同孔径的蚕丝蛋白支架;贴壁法分离脐带间充质干细胞,化学染色检测其体外诱导成骨和成脂的能力;电镜下测定6批次蚕丝蛋白支架的孔径;观察脐带间充质干细胞在不同孔径蚕丝蛋白支架上黏附、增殖的能力.结果与结论:6批次蚕丝蛋白支架的孔径分别为:(39.94±17.27),(53.51±16.18),(63.97±19.76),(71.08±18.07),(87.33+21.78),(121.97+44.10)μm.脐带间充质干细胞在2号支架材料上黏附良好,并充分伸展,而第1,3,4,5,6号支架材料,除第1,3号支架上偶见细胞外,其余支架材料上均未见细胞生长.由此说明人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪时,支架材料的佳孔径为50 μm.
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肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响
背景:在脂肪组织工程的研究中,若将种子细胞与支架材料复合后移植,则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪.肝细胞生长因子可以促进血管生成、减少纤维组织增生.目的:观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响.设计、时间及地点:随机区组设计的动物实验,于2006-08,2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成.材料:纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞-支架复合物. 方法:①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞,诱导成脂,携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞牛长因子基因的苇组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞,流式细胞仪测定转染效率,应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达,将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架.②将75只Wistar雌性大鼠按随机数宁表法分为3组:脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿色荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间.主要观察指标:移植后3,7,14,28,60 d.每组各取5只大鼠麻醉后处死,取出移植物.电镜观察国;并行苏木精一伊红、油红O、Masson's染色,观察病理改变;同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生长因子表达,观察并计数血管生成.结果:①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴,重组腺病毒感染复数=100时,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64.39%.②移植3,7,14 d时,Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组(P<0.05),且3 d达到高峰.③移植3,7,14,28,60d时,Ad-肝细胞生长冈子转染组移植物中血管生成高于其他组(P<0.05),且7d时血管增加的幅度大.④移植28,60d时,Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组,电镜下脂肪细胞也多于其他组.结论:携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子,促进移植组织工程脂肪血管生成,进而促进移植组织的成活.
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组织工程化脂肪的构建与应用
背景:软组织缺损的修复是整形外科的重要难题,而目前用于临床治疗的各种方案都存在一定缺陷.目的:对脂肪组织工程的研究现状进行相应的探讨,分析目前所采用方案的缺陷,并对其将来可能的临床应用进行相应展望.方法:以adipose tissue engineering,mesenchymal stem cells,derived from adipose tissue为检索词,检索Medline数据库(1991-01/2009-05);以脂肪,组织工程,间充质干细胞为检索词,检索中国期刊全文数据库(1991-01/2009-05).文献检索语种限制为英文和中文.纳入与组织工程化脂肪组织构建相关的内容,排除重复研究.结果与结论:计算机初检得到342篇文献,根据纳入排除标准,对33篇进行分析.在探索软组织缺损治疗方法的过程中发现:组织工程技术能以少量种子细胞,经体外扩增后与生物材料复合,修复较大的组织或器官缺损,重建生理功能,为真正实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径.当前已有多种成功构建脂肪组织的策略用于治疗软组织缺损,这将给填充脂肪组织修复软组织缺损开辟广阔的天空.
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壳聚糖修饰丝素蛋白与人脂肪间充质干细胞体外构建组织工程脂肪
背景：在保留丝素蛋白原有优点的基础上，采用带正电荷的水溶性壳聚糖对其表面进行修饰，可改善细胞在支架材料上的黏附性。目的：验证壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料与人脂肪间充质干细胞的生物相容性及两者体外构建组织工程脂肪的可行性。方法：将第3代人脂肪间充质干细胞悬液以1×107 L-1浓度接种于壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上作为实验组，以单纯的细胞悬液为对照组，MTT法检测细胞在支架材料上的黏附和增殖能力。将第3代人脂肪间充质干细胞悬液以1×109 L-1浓度接种于壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上，分别进行成脂诱导培养与高糖培养基常规培养，14 d后行细胞-支架复合物油红O染色与RT-PCR检测。结果与结论：人脂肪间充质干细胞在壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料上黏附、增殖良好。成脂诱导14 d后，油红 O 染色显示壳聚糖修饰丝素蛋白支架材料上有大量脂肪细胞生成，且过氧化物酶增殖物活化受体γ2基因表达阳性。结果表明壳聚糖表面修饰丝素蛋白支架材料具有良好的体外生物相容性，与人脂肪间充质干细胞共培养可被成功诱导为成熟脂肪细胞。
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人脂肪来源细胞体内构建组织工程化脂肪的实验研究
目的 探讨以组织工程技术,应用脂肪来源细胞(Adipose-derived cells,ADCs)体内构建脂肪组织的可行性.方法 吸脂术获得人脂肪组织,一部分直接植入裸鼠体内;另一部分用酶消化法分离、培养ADCs,将第三代细胞接种于纤维凝胶(Fibrin glue)支架中,经成脂肪培养液诱导1周后,植入裸鼠体内,4周后取材,用称重法及油红、HE染色检测结果.实验分为直接注射脂肪组、单纯支架组、细胞-支架复合体脂肪诱导组、非诱导组.结果 直接注射组在裸鼠皮下形成脂肪组织,但吸收量大;细胞一支架复合体诱导组有大量脂肪类组织形成,油红染色显示组织有脂滴形成;细胞一支架复合体非诱导组和单纯支架组均未发现脂肪组织形成.结论 采用组织工程技术将吸脂术获得脂肪来源细胞接种纤维凝胶支架,体内构建脂肪组织,具有可行性.
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携带肝细胞生长因子基因慢病毒转染人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪的实验研究
目的 探讨构建可注射型组织工程脂肪的可行性,为临床软组织缺损修复及美容填充提供简便易行的方法.方法 取脂肪抽吸术获取的脂肪组织,采用酶消化法分离培养获得人脂肪来源干细胞(humanadipose-derived stem cells,hADSCs),进行细胞形态观察、流式细胞术及成脂诱导鉴定.用携带肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒HGF-GFP-LVs,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)(分别为10、30、50、100)转染hADSCs,计算转染效率以确定适MOI.取SPF级6周龄单纯T细胞缺陷BALB/c雌性裸鼠10只,将经过适MOI HGF-GFP-LVs转染并成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入裸鼠背部右侧皮下(转染组),单纯成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入背部左侧皮下(未转染组),单纯纤维蛋白胶注入颈后正中皮下(空白对照组),每点注射0.4 mL.移植后12周处死裸鼠,取出移植物,行大体观察、湿重测量、HE染色、GFP荧光标记检测及免疫荧光染色观察,评价种子细胞的体内成脂能力以及移植物血管新生情况.结果 经鉴定所培养细胞为hADSCs.MOI为10和30时HGF-GFP-LVs转染率较低,MOI为50和100时转染率较高(均＞80％),确定适MOI为50.移植12周,转染组和未转染组均获得外观类似脂肪组织的新生物,湿重分别为(32.30±4.06) mg和(25.27±3.94) mg,差异有统计学意义(t=3.929,P=0.001);空白对照组未见新生物.转染组新生脂肪细胞数为(126.93±5.36)个/视野,显著高于未转染组的(71.36±4.52)个/视野(t=30.700,P=0.000).荧光显微镜下可见部分单房脂肪细胞发出网状绿色荧光.免疫荧光染色示转染组血管密度为(16.37±2.76)个/视野,显著高于未转染组的(9.13±1.68)个/视野(t=8.678,P=0.000).结论 以hADSCs为种子细胞,经慢病毒转染HGF基因并成脂诱导后与纤维蛋白胶支架复合可在体内成功构建成熟脂肪,能促进移植后的血管新生,从而提高移植物的存活率.
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人脂肪干细胞复合猪小肠黏膜下层脱细胞基质/壳聚糖温敏凝胶体内构建组织工程脂肪的研究
目的 探讨人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)与猪小肠黏膜下层脱细胞基质微粉(small intestinal submucosa powder,SISP)/壳聚糖温敏水凝胶复合构建组织工程脂肪的可行性.方法 取乳癌患者自愿捐赠脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离hADSCs.取第3代细胞与SISP/壳聚糖温敏水凝胶混匀,制成浓度为1×106个/mL的液态凝胶.将24只S周龄健康雌性裸鼠随机分为实验组及对照组(n=12),于颈背部皮下分别注射1 mL hADSCs+SISP/壳聚糖温敏水凝胶或SISP/壳聚糖温敏水凝胶.注射后0、1、2、4、8周测量植入物体积,评价其降解情况;注射后1、2、4、8周两组各处死3只裸鼠,大体观察后取材行组织学及免疫组织化学染色观察,评价植入物成分构成变化(HE染色)、成脂能力(油红O染色)、血管形成情况(CD31标记)及材料内hADSC存活分化(人波形蛋白标记). 结果 注射后随时间延长,两组植入物均逐渐缩小;但各时间点实验组植入物体积均大于对照组,且8周时差异有统计学意义(t=3.348,P=0.029).大体观察示各时间点两组植入物均边界清楚、无粘连,至8周时均可见黄色新生组织,且表面有毛细血管包裹.组织学观察示,注射后植入物结构逐渐变紧密,SISP逐渐降解,且实验组降解速度较对照组慢,脂肪逐渐形成,至8周时实验组中央出现少量成熟脂肪组织;各时间点实验组油红O染色阳性面积均大于对照组,且8周时差异有统计学意义(t=3.411,P=0.027).免疫组织化学染色示,各时间点实验组均有hADSCs存活;植入物有新生血管生成,2周时达峰值,各时间点两组CD31阳性面积比较差异无统计学意义(P＞0.05),但实验组植入物中血管化更均匀.结论 SISP/壳聚糖温敏水凝胶可作为载体,复合hADSCs植入裸鼠体内后可构建组织工程脂肪.
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脂肪干细胞构建可注射型组织工程脂肪的研究进展
目的 总结近年来以脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞构建可注射型组织工程脂肪的研究进展.方法 检索国内外ADSCs复合可注射型三维支架材料构建组织工程脂肪的相关研究文献,主要对ADSCs特性、可注射型支架材料创新、分化诱导方式和促进血液供应等方面研究成果进行总结.结果 ADSCs具有数量充足、强大的分泌功能等特性,与多种可注射型支架材料复合后相容性良好,辅以生长因子等促进血液供应的策略,可构建多种形式的可注射型组织工程脂肪.结论 以ADSCs为种子细胞构建可注射型组织工程脂肪虽然面临诸多亟待解决的问题,但其可能为临床上修复软组织缺损和整形填充提供一种优良、易操作的可注射型填充材料.
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不同移植部位对组织工程化脂肪存活的影响
目的：采用人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)与蚕丝蛋白生物支架构建组织工程化脂肪组织，研究不同移植部位对组织工程化脂肪存活的影响。方法：将人脐带间充质干细胞接种于蚕丝蛋白支架上，体外成脂诱导培养1-2周，扫描电镜观察细胞在支架上的生长及黏附情况；同时，将细胞-支架复合物分别移植于6只Wistar雌性大鼠背部皮下和股二头肌内，观察其成脂及存活情况。结果：移植8周、12周后，组织冰冻切片油红0染色、HE染色及扫描电镜显示，实验组移植复合物内有脂肪细胞生成，背部移植复合物表面皮肤结合紧密，与底部肌肉组织结合疏松，体积较移植前增大，支架材料随移植时间延长逐渐降解；股二头肌内移植复合物移植8周后，与肌肉组织结合紧密，但体积较移植前明显减小，支架材料降解明显，到移植12周后移植处不见移植物存在。空白对照组移植物内无脂肪细胞生成，移植物体积较植入前减小，股二头肌内移植物减小更明显；股二头肌内移植物移植12周后，移植处不见移植物存在。结论：蚕丝蛋白生物支架具有良好的三维空间结构和生物降解性，人脐带间充质干细胞接种于蚕丝蛋白生物支架可用于组织工程化脂肪组织的研究；不同移植部位对该组织工程化脂肪存活有一定的影响，而背部皮下为良好的移植位点。
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局部组织工程室诱发组织新生的实验研究
目的 探索组织工程室诱导脂肪组织新生的模式.方法 取成年雄性新西兰大白兔12只,分离背部脂肪瓣将其一半植入背部同期构建的组织工程室内,1个月时,进行取材.取腹股沟脂肪瓣作为对照组.结果 1个月时,组织工程室内构建物未充满工程室,小室内脂肪组织与小室外体积相当.使用排水法测量体积为(11.17±1.97)ml,增大(744±132)％.组织学观察为成熟的脂肪组织.结论 脂肪组织工程室不仅能诱导其内的脂肪再生.亦可诱导脂肪组织工程室外的脂肪组织再生.
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人脂肪间充质干细胞与脐静脉内皮细胞共培养与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的体外研究
目的 探讨人脂肪间充质干细胞(hADSCs)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养后,共培养体系与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性.方法 从人体正常脂肪组织中提取hADCSs,培养并扩增,行成脂及成骨诱导鉴定hADCSs的多向分化特性;流式细胞术检测hADCSs表面分子CD34、CD44、CD45、CD90,检测HUVEC表面分子CD31及CD34;测定hADCSs与HUVEC增殖曲线,探讨共培养比例;将共培养体系种植于丝素蛋白支架后行电镜扫描;成脂诱导14d后,反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定成脂基因PPARγ-2的表达.结果 hADSCs可以向脂肪细胞及成骨细胞分化;流式细胞术检测hADSCs结果显示CD34(+)、CD44(+)、CD45(-)、CD90(-),检测HUVEC结果显示CD31(+)、CD34弱阳性;HUVEC增殖速度快于hADSCs,以HUVEC:hADSCs为1∶4比例接种于培养皿培养3d后,细胞融合时两者比例约为1∶1;共培养体系接种于丝素蛋白支架成脂诱导14d后,通过RT-PCR成功测定出PPARγ-2基因的表达.结论 hADSCs与HUVEC共培养,在体外可成功构建出组织工程脂肪.
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血管内皮生长因子165基因修饰的人脂肪间充质干细胞与改性丝素蛋白体内构建血管化组织工程脂肪的研究
目的：探讨血管内皮生长因子165（VEGF165）基因修饰的人脂肪间充质干细胞（hADSCs）与壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法分离提取hADSCs，选取生长状态良好的第3代hADSCs，用携带重组人VEGF165基因的慢病毒进行感染（感染复数=50）。选用慢病毒感染和未感染的第3代hADSCs分别接种于支架材料上，记为实验组与对照组，同时成脂诱导5 d后，使用氯甲基苯甲酰胺标记细胞。取24只雌性Wistar大鼠，将上述实验组与对照组细胞—支架复合物移植于背部皮下，每组12只。移植后8，12周分别取材并行冰冻切片、HE染色、油红O染色及扫描电镜，同时观察支架材料的降解情况，观察移植物。免疫印迹法检测VEGF165及过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2（PPARγ-2）蛋白的表达。结果移植后8，12周，免疫印迹法结果显示实验组移植物均表达VEGF165，对照组未见表达；实验组与对照组均表达PPARγ-2，实验组中的表达量明显多于对照组（P<0.05）。扫描电镜、油红O染色及HE染色均表明实验组与对照组生成大量脂肪样细胞，且实验组明显多于对照组（P<0.05）。结论携带重组人VEGF165基因的慢病毒感染的hADSCs与壳聚糖/丝素蛋白支架材料复合物在大鼠体内可持续表达VEGF165及PPARγ-2蛋白，能显著促进工程化脂肪组织的构建，为血管化组织工程脂肪的构建奠定了基础。
