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重组人碱性成纤维细胞生长因子对人脂肪干细胞分化为脂肪细胞的影响
目的 探讨不同浓度重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibro-blast growth factor,rh-bFGF)对体外培养的人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs)诱导分化为脂肪细胞的影响,通过实验寻找促进hASCs向脂肪细胞转化的佳浓度.方法 取健康脂肪抽吸者脂肪混悬液进行分离提取hASCs,进行hASCs的培养、鉴定和成脂诱导分化,并在成脂诱导的细胞中分别加入0 ng/ml rh-bFGF作为对照组,加入10、20、40 ng/ml外源性rh-bFGF作为实验组.MTT比色法检测成脂细胞的增殖速率,油红O染色定性分析新形成脂肪细胞的时间,利用Western印迹法检测成熟脂滴表面标记蛋白CIDEC的表达.结果 添加40ng/mlrh-bFGF的脂滴形成平均时间为(11.5±1.9)h,检测细胞增殖的吸光度值平均为0.52±0.10,10、20、40 ng/mlrh-bFGF对细胞的增殖均有促进作用,尤以40ng/ml浓度为明显,40ng/mlrh-bFGF成熟脂滴表面蛋白CIDEC的表达量高于其他组.结论 在hASCs成脂诱导剂中添加rh-bFGF能有效促进成脂细胞的增殖速率,加速hASCs向脂肪细胞的分化,其中以40ng/ml rh-bFGF为佳浓度.
关键词： 人脂肪来源干细胞 重组人碱性成纤维细胞生长因子 脂肪细胞 成脂诱导 -
碱性成纤维细胞生长因子影响脂肪干细胞的血管内皮迁移
背景：良好血运机制的建立是工程化组织成功植入的关键。
目的：观察外源性碱性成纤维细胞生长因子对植入小鼠皮下的人脂肪来源干细胞-透明质酸钠复合物中人脂肪来源干细胞向血管内皮迁移情况的影响。
方法：由吸脂术所得的脂肪组织中分离提取人脂肪来源干细胞进行培养传代，取第3代人脂肪来源干细胞进行cm-dil荧光标记后制成5×109 L-1的细胞悬液，碱性成纤维细胞生长因子配成2 mg/L的工作液。将由0.25 mL透明质酸钠凝胶、0.2 mL细胞悬液和0.05 mL工作液/DMEM混合制成的碱性成纤维细胞生长因子组/对照组移植物分别植入小鼠背部左右两侧皮下作自身对照，6周后取材，行苏木精-伊红染色和免疫荧光标记血管内皮细胞进行观察分析。
结果与结论：植入处未出现结节、坏死及液化，取材时无凝胶残留。苏木精-伊红染色见标本性质多为脂肪组织及疏松结缔组织。荧光显微镜下仍可见标记人脂肪来源干细胞的cm-dil荧光，其与标记小鼠血管内皮的FITC荧光重合数碱性成纤维细胞生长因子组多于对照组(P<0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子促进透明质酸钠支架中的人脂肪来源干细胞向血管内皮迁移、分化。 -
雌激素促进人脂肪间充质干细胞增殖及成脂分化应用的研究
目的 探讨不同浓度雌激素对人类脂肪组织来源干细胞生长增殖以及定向分化成脂肪细胞的影响.方法 对3例患者行脂肪抽吸术,并进行脂肪组织来源干细胞的分离培养及传代,利用流式细胞仪技术对细胞表面标志物进行鉴定,采用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)法测定不同浓度的雌激素对脂肪组织来源干细胞生长增殖的影响,将第3代的脂肪组织来源干细胞分为单纯培养组、单纯成脂诱导组,雌激素不同浓度1×10-6 M、1×10-8 M、1×10-10 M处理成脂诱导组,分别定向诱导分化14d后,经油红O染色,通过RT-PCR方法分析产物中LPL和PPAR-γ2基因的表达情况.结果 流式细胞仪对其表面标志物进行检测,CD29、CD105和CD44阳性,CD31和CD34阴性,排除其为造血干细胞可能; 通过CCK-8法检测雌激素为1×10-8 M时可以明显促进干细胞的生长增殖,并能促进脂肪组织来源干细胞向脂肪细胞分化,RT-PCR检测雌激素处理组较单纯诱导组脂肪细胞特异性表达基因LPL及PPAR-γ2 表达强烈.结论 雌激素在浓度为1×10-8 M时可以明显促进脂肪组织来源干细胞生长增殖及向脂肪细胞的定向分化,为雌激素辅助干细胞在组织工程上的应用提供理论和实验依据.
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人脂肪来源干细胞的分离、培养及成骨分化的研究
目的 体外分离、培养、扩增及鉴定人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hASCs),并向成骨诱导分化,为临床骨组织重建提供种子细胞.方法 应用胶原酶消化法和贴壁筛选法相结合从人手术切除的脂肪组织中提取hASCs.MTS法绘制hASCs生长曲线;利用流式细胞术检测hASCs表面标志;以低糖DMEM含10%FBS及1%青/链霉素为基础培养基,含1nM地塞米松,10mM 磷酸甘油,0.05 mM维生素C的条件培养基连续培养4w进行体外成骨诱导,并利用硫酸茜红素 S(Alizarin Red S)染色检测钙沉积情况.结果 成功从人脂肪组织中分离、提取了hASCs并在体外扩增.hASCs呈成纤维细胞样生长.生长曲线显示hASCs增生分裂能力活跃.hASCs表面标志表达CD29,CD44,CD73,CD105和CD166,不表达CD31,CD34,CD45和HLA-DR.成骨诱导4w后,经硫酸茜红素S染色可见:细胞呈复层生长,细胞外富集细胞外基质,基质经染色呈现橘红色,数量多,成结节状或成片状存在,并出现钙盐结节,证明有钙盐沉积.结论 成功建立了一种简单有效的体外分离和培养hASCs的方法.获得的hASCs生长增殖旺盛、保存方便,具有多向分化能力.hASCs可以作为细胞移植治疗和组织工程理想的种子细胞.
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人脂肪来源干细胞与膀胱脱细胞基质-丝素蛋白双层支架的生物相容性研究
目的：观察人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells，hASCs）在膀胱黏膜下脱细胞基质-丝素蛋白（Bladder acellular matrix graft-silk fibroin，BAMG-SF）双层支架材料中的生长情况，分析其生物相容性。方法取hASCs，置于BAMG-SF浸提液中培养，CCK-8法检测其细胞活力，评价BAMG-SF支架的细胞毒性并绘制生长曲线。扫描电镜观察BAMG-SF双层支架材料的表面形貌。将hASCs传代扩增后接种到BAMG-SF双层支架材料上，体外培养1周后，转至裸鼠皮下培养1周、2周，HE染色观察细胞在支架上的生长情况。HLA免疫荧光鉴定裸鼠皮下双层支架上细胞的种属来源。结果 hASCs在BAMG-SF双层支架浸提液中可保持较高的增殖率，根据细胞相对增殖率与细胞毒性分级关系证实BAMG-SF双层支架浸提液无细胞毒性。由hASCs在BAMG-SF浸提液和DMEM培养基中的生长曲线可知，BAMG-SF有利于hASCs的生长。将hASCs接种到BAMG-SF双层支架材料上，经过体外、内培养，hASCs均能长入支架的空隙内，且体内培养比体外培养有更多的hASCs细胞长入支架。 HLA检测显示支架内细胞部分为hASCs。结论新型BAMG-SF双层支架材料安全无毒，与hASCs生物相容性好，可作为细胞载体应用于组织工程膀胱的研究。
关键词： 人脂肪来源干细胞 膀胱黏膜下脱细胞基质 丝素蛋白 双层支架材料 组织工程 -
人脂肪来源干细胞与左旋聚乳酸/聚己内酯支架的体内外生物相容性研究
目的 观察人脂肪来源干细胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)在左旋聚乳酸/聚己内酯(Poly-L-lactide/Polycaprolactone,PLLMPCL)复合支架材料中的生长情况及其生物相容性.方法 体外分离、培养和扩增hADSCs,制备PLLA/PCL复合支架.取PLLA/PCL浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性.hADSCs传代扩增后,接种到PLLA/PCL支架材料上.体外培养1周,裸鼠皮下分别培养1周、2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况.免疫荧光检测裸鼠体内复合支架材料内细胞平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin,SMA)表达情况.结果 hADSCs在PLLA/PCL浸提液中可保持较高的增殖率,表明PLLA/PCL浸提液无细胞毒性.hADSCs接种于PLLA/PCL支架上,经体外、体内培养后,均能长入PLLA/PCL支架的孔隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架内部.经体内培养后,复合细胞的支架比单纯支架有更多的细胞渗入支架内部.细胞材料复合物体内培养2周后,免疫荧光检测发现,支架材料内部分细胞SMA表达阳性.结论 PLLA/PCL复合支架材料,安全无毒,与hADSCs生物相容性好,可作为种子细胞的载体用于组织工程膀胱缺损修复的研究.
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人脂肪来源干细胞与聚己内酯／壳聚糖支架的生物相容性研究
目的 观察人脂肪来源干细胞(Human adipose derived stem cells,hADSCs)在聚己内酯／壳聚糖[Poly(e-caprolactone)/chitosan,PCL/CS]支架中的生长情况.方法 取PCL/CS浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架细胞毒性.hADSCs传代扩增后,接种到PCL/CS支架上,体外培养1周、2周,裸鼠体内培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况,免疫组化HLA-I监测经裸鼠体内培养后复合支架上细胞的种属来源.结果 hADSCs在PCL/CS浸提液中可保持较高的增殖率,PCL/CS浸提液无细胞毒性.hADSCs终止于PCL/CS支架后,经过体外、内培养,hADSCs均能长人支架的空隙内,且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架.体外培养1周,已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘,体外培养2周后,部分细胞渗透到材料内部.体内培养2周后,大量细胞能渗透到材料内部,同时HLA-Ⅰ抗体检测发现,支架材料内部分细胞HLA-Ⅰ阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于hADSCs.结论 PCL/CS支架安全无毒,hADSCs能在PCL/CS支架上较好生长,该支架可用于组织工程膀胱的研究.
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携带肝细胞生长因子基因慢病毒转染人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪的实验研究
目的 探讨构建可注射型组织工程脂肪的可行性,为临床软组织缺损修复及美容填充提供简便易行的方法.方法 取脂肪抽吸术获取的脂肪组织,采用酶消化法分离培养获得人脂肪来源干细胞(humanadipose-derived stem cells,hADSCs),进行细胞形态观察、流式细胞术及成脂诱导鉴定.用携带肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒HGF-GFP-LVs,以不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)(分别为10、30、50、100)转染hADSCs,计算转染效率以确定适MOI.取SPF级6周龄单纯T细胞缺陷BALB/c雌性裸鼠10只,将经过适MOI HGF-GFP-LVs转染并成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入裸鼠背部右侧皮下(转染组),单纯成脂诱导的hADSCs与纤维蛋白胶混合注入背部左侧皮下(未转染组),单纯纤维蛋白胶注入颈后正中皮下(空白对照组),每点注射0.4 mL.移植后12周处死裸鼠,取出移植物,行大体观察、湿重测量、HE染色、GFP荧光标记检测及免疫荧光染色观察,评价种子细胞的体内成脂能力以及移植物血管新生情况.结果 经鉴定所培养细胞为hADSCs.MOI为10和30时HGF-GFP-LVs转染率较低,MOI为50和100时转染率较高(均＞80％),确定适MOI为50.移植12周,转染组和未转染组均获得外观类似脂肪组织的新生物,湿重分别为(32.30±4.06) mg和(25.27±3.94) mg,差异有统计学意义(t=3.929,P=0.001);空白对照组未见新生物.转染组新生脂肪细胞数为(126.93±5.36)个/视野,显著高于未转染组的(71.36±4.52)个/视野(t=30.700,P=0.000).荧光显微镜下可见部分单房脂肪细胞发出网状绿色荧光.免疫荧光染色示转染组血管密度为(16.37±2.76)个/视野,显著高于未转染组的(9.13±1.68)个/视野(t=8.678,P=0.000).结论 以hADSCs为种子细胞,经慢病毒转染HGF基因并成脂诱导后与纤维蛋白胶支架复合可在体内成功构建成熟脂肪,能促进移植后的血管新生,从而提高移植物的存活率.
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人脂肪来源干细胞成软骨分化过程中成软骨相关微小RNA表达的初步研究
目的 探讨微小RNA (microRNA,miRNA)在人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)诱导成软骨分化过程中的表达规律及其影响软骨分化的可能机制.方法 取行抽脂术或其他腹部手术患者自愿捐赠的脂肪组织,分离、培养hADSCs并鉴定.取第3代细胞成软骨分化,倒置相差显微镜下观察细胞形态,于诱导21 d行阿尔新蓝染色观察软骨形成情况,诱导0、7、14、21 d行ELISA检测成软骨相关蛋白Ⅱ型胶原蛋白(colagentypeⅡ,Col2a1)、蛋白聚糖(Aggrecan)、Col10a1以及硫酸软骨素表达.采用基因芯片技术筛选hADSCs成软骨诱导前及诱导后21d差异性表达miRNA,并预测筛选出的miRNA靶基因.结果 实验成功培养hADSCs,经成软骨诱导培养后,随时间延长可形成软骨球;21d阿尔新蓝染色呈阳性;hADSCs成软骨诱导后7、14、21d,Col2a1、Aggrecan、Col10a1及硫酸软骨素表达水平均较成软骨诱导前hADSCs显著增高,差异均有统计学意义(P＜0.05).基因芯片技术共筛选出11个差异性表达miRNA,其中7个miRNA表达上调,4个miRNA表达下调.筛选出的成软骨相关miRNAs预测靶基因可能参与了干细胞成软骨分化、增殖、凋亡、细胞周期调控,以及介导细胞内级联反应和自我更新等.结论 实验筛选出11个成软骨分化差异性表达超过2倍的miRNAs,并对其靶基因进行预测,加深了对hADSCs成软骨分化机制的理解,为定向控制hADSCs成软骨分化及筛选组织工程改良种子细胞提供了理论依据.
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自体PRP促进人脂肪来源干细胞成骨分化的体外实验研究
目的 探讨自体PRP对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 取自愿捐献吸脂术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs,倒置显微镜下观察细胞生长情况.将第3代ADSCs分别行成脂、成软骨定向诱导培养鉴定,并行CD29及CD44免疫荧光染色观察.取第3代ADSCs分别采用含10 mL/L PRP的成骨诱导培养基(PRP组)和不含PRP的成骨诱导培养基(对照组)进行培养,倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5 d采用MTT法检测细胞增殖活性;7、14、21、28 d行ALP活性检测,另取培养7、14 d的PRP组细胞行ALP染色观察;14 d时行PRP组茜素红染色检测钙结节形成情况.结果 倒置显微镜下第3代ADSCs多为梭形,倍增时间约35 h.成脂及成软骨诱导鉴定均为阳性,免疫荧光染色CD29和CD44呈阳性.MTT法示PRP组1、2、3、4、5 d的吸光度值分别为0.137±0.015、0.219±0.023、0.367±0.031、0.586±0.039、0.948±0.046,对照组分别为0.081±0.009、0.115±0.012、0.162±0.017、0.242±0.025、0.356±0.032,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导7 d后,PRP组ALP染色阳性,细胞胞浆呈灰黑色,可见黑色沉淀:14 d后阳性细胞增多.ALP活性检测示PRP组7、14、21、28 d细胞活性值分别为23.96±2.05、41.26±3.38、38.12±3.03、35.89±2.24,对照组分别为17.83±1.62、26.64±2.37、23.85±1.99、20.78±1.81,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).成骨诱导14 d后,茜索红染色示PRP组钙结节形成.结论 体外培养时,自体PRP可促进人ADSCs的增殖并诱导成骨分化,为骨组织工程提供一种新的种子细胞来源.
