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钠-氢交换蛋白1反义表达载体对人肺腺癌细胞钠-氢交换蛋白1基因表达的影响及其意义
目的探讨Na+/H+交换蛋白1(NHE-1)反义表达载体(pNHE-1)对人肺癌细胞NHE-1基因的抑制作用及生物学效应.方法实验细胞分为3组, A549- pNHE-1组(反义组)、A549空载体组(空载体组)、A549对照组(A549组).采用阳离子脂质体使pNHE-1转染人肺腺癌A549细胞株.采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定3组细胞的NHE-1 mRNA表达水平;用荧光法测定3组细胞内pH(pHi)值;了解转染细胞增殖生长状况;用细胞凋亡原位检测法检测3组细胞凋亡率.结果在转染细胞基因组DNA中扩增出外源真核表达载体的DNA片段,证明转染成功.半定量RT-PCR法证实反义组细胞的NHE-1 mRNA表达水平(0.42±0.06)显著低于A549组(0.71±0.08,P＜0.01)和空载体组(0.69±0.16,P＜0.01).A549组细胞在培养12、24和48 h后pHi值分别为7.150±0.004、7.140±0.007和7.120±0.008,反义组pHi值分别为6.990±0.005、6.840±0.005和6.750±0.005,两组差异均有极显著性(P<0.01).A549组、空载体组和反义组的细胞倍增时间分别为3.20、3.28和4.97 d,反义组细胞的增殖、生长明显慢于A549组及空载体组(P＜0.01).反义组细胞凋亡率为(24.50±3.62)%,显著高于A549组的(1.50±0.55)%和空载体组的(2.20±0.75)%(均P＜0.01).结论 pNHE-1可成功转染到A549细胞基因组中,并可抑制转染细胞NHE-1 mRNA的表达,通过降低Na+/H+交换活性,使肿瘤细胞pHi明显降低、细胞增殖生长速度明显减慢、凋亡率显著增高.
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钠/氢离子交换抑制剂心保护研究进展
心肌细胞内Ca2+超载是心肌缺血/再灌注损伤的决定性因素,现知心肌内Ca2+超载是由于心肌缺血时细胞内Na+/K+-ATP酶活性降低,细胞内H+浓度升高,激活Na+/H+交换通道(Na+/H+ex-changer,NHE),使细胞内H+浓度下降,Na+浓度升高,导致Na+/Ca2+交换机制增强,结果细胞内Ca2+积累,造成Ca2+超载,引起心肌细胞损伤[1].Na+/H+交换抑制剂(Na+/H+exchange inhibitor,NHEI)能抑制Na+/H+交换,从而减轻心肌缺血/再灌注损伤.
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靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立
目的:构建靶向人钠氢交换蛋白-1(NHE-1)RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础.方法:利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA(miRNA)的重组干扰质粒pcDNA(TM)6.2-GW/miR和阴性对照质粒DcDNA(TM)6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数(MOI)值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞佳MOI值,以佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值.结果:聚合酶链反应(PCR)提示佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞佳MOI值为160.当佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04.不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(24h:P=0.002.0.015;48h:P=0.030,0.012;72h:P=0.018,0.010);但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点(24、48和72h)SH-SY5Y细胞内pH值差异元统计学意义(P=0.762).结论:佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具.
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Cariporide对肿瘤细胞增殖和血管内皮生长因子表达的影响
目的:探讨特异性抑制剂Cariporide通过抑制钠氢离子交换蛋白1(NHE1)功能而阻止肿瘤细胞增殖的机制.方法:应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Cariporide对细胞增殖的抑制率,共聚焦荧光显微镜测算双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)的荧光强度,检验其下调细胞内pH值,ELISA试剂盒测定其对体外培养细胞表达和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响,观测其对动物体内肿瘤细胞增殖的抑制作用.结果:随着Cariporide的剂量增加或作用时间延长,HeLa细胞内pH值逐渐降低,肿瘤细胞表达VEGF减少.伴随着细胞内pH值降低,VEGF分泌水平逐渐下降,两者之间呈显著相关性(P＜0.05).另外,Cariporide能抑制动物体内的肿瘤增殖.结论:Cariporide能够减少肿瘤细胞表达和分泌VEGF,抑制动物体内肿瘤增殖.
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姜半夏乙醇提取物对人胃腺癌SGC7901细胞内pH值的影响
目的:观察姜半夏乙醇提取物对人胃腺癌SGC7901细胞内pH值的影响.方法:不同浓度姜半夏乙醇提取物(终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125 mg/mL)处理SGC7901细胞后,通过甲基噻唑基四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测细胞增殖状况,使用2,7-双（2-羧基乙基）-5(6)-羧基荧光素四（丙酰甲酯）（2,7-bis-（2-carboxyethyl）-5-carboxyfluorescein-acetoxymethyl,BCECF-AM）荧光探针检测细胞内pH值,pH计测定胞外培养基的pH值；采用荧光定量聚合酶链反应技术检测药物干预细胞72 h后细胞钠氢交换蛋白1（Na+/H+ exchanger isoform 1,NHE1）和空泡质子转运ATP酶(vacuolar-H +-ATPase,V-ATPase)基因的表达水平.结果:不同浓度姜半夏乙醇提取物均能不同程度地抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖,降低细胞内pH值,提高细胞外培养基pH值.0.5 mg/mL姜半夏乙醇提取物可下调SGC7901细胞V-ATPase和NHEl mRNA的表达.结论:姜半夏乙醇提取物具有降低SGC7901细胞内pH值的作用,其机制可能与抑制细胞V-ATPase和NHEl mRNA表达有关.
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先心病肺高压患者肺组织中NHE-1 mRNA的表达变化及其意义
目的:检测肺组织中钠氢交换体1型(NHE-1) mRNA的表达变化,初步探讨引起先天性心脏病(先心病)肺动脉高压(肺高压)的机制.方法:先心病手术病例分为无肺高压组(12例,sPAP<3.99 kPa)和伴肺高压组(9例, sPAP≥3.99 kPa),以正常普胸手术病例(6例)为对照.标本取自右肺中叶,切片H-E染色作病理检查,采用 Northern 印迹法检测标本中NHE-1 mRNA的表达.结果:先心病患者肺组织中NHE-1 mRNA的表达水平均显著高于对照组(P<0.01),而先心病伴肺高压组又显著高于无肺高压组(P<0.05).结论:(1)NHE-1 mRNA表达水平增高早于肺动脉压力的变化及肺血管平滑肌的增殖;(2)NHE-1 mRNA 表达水平增高,通过蛋白数量的增加来调节工作效率,可能是先心病异常的肺血流引起肺小血管中层增厚、肺高压形成的一个原因.
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Cariporide和维拉帕米防止家兔快速心房起搏所致电重构
目的探讨家兔快速心房起搏所致的心房肌电重构的机制及钠氢离子交换体抑制剂Cariporide和L型钙通道阻断剂维拉帕米的防治效果.方法36只家兔随机分为3组:快速心房起搏对照组(对照组)、快速心房起搏+Ca-riporide组(Cariporide组)、快速心房起搏+维拉帕米组(维拉帕米组),每组12只.经颈内静脉将电极置入右心房,以600次/min行快速心房起搏,测定基础状态、给药后0.5 h和起搏后0.5、1、2、4、6、8 h的心房有效不应期(AERP200、AERP150和AERP130),取起搏8 h的兔右心耳组织,观察超微结构.结果快速心房起搏后对照组的AERP缩短,AERP的频率适应不良,同基础状态比较差异有显著性意义(P＜0.01),心房肌细胞损伤的超微结构变化明显.Cariporide组和维拉帕米组上述改变得以逆转和减轻.结论心房肌细胞内钙水平的增高在快速起搏导致的心房肌电重构中起作用,钠氢离子交换体活化是引起钙超载的原因之一.
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钠氢交换子1在醛固酮导致脏器纤维化中的可能作用
研究表明醛固酮和脏器纤维化关系密切,而Na+/H+交换子1(NHE1)可能也参与了脏器纤维化的发生,本文就NHE的结构和活性调节、醛固酮的合成和作用机制以及NHE1在醛固酮导致脏器纤维化中可能起到的作用作一综述.
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Cariporide 对兔心房电重构的影响
目的:探讨钠氢交换体Ⅰ型(NHE-1)特异性抑制剂cariporide对快速起搏所致兔心房电重构的影响.方法:30只兔随机等分为3组:对照组、起搏组和cariporide组.起搏组和cariporide组给予6 h 600 beats/min的快速心房起搏.测定各组不同时点的心房有效不应期(AERP200,AERP150,AERP130),连续刺激6 h后取左右心耳组织,用Western blotting测定NHE-1的含量.结果:在快速起搏后1 h后,起搏组的AERP200较起搏前明显缩短,2 h时达高峰,相对缩短量为(15.63±9.04)ms,而对照组和cariporide组AERP未发生明显变化,起搏2h时相对缩短量为(1.43±2.44)ms和(1.43±6.90)ms(P<0.05,与起搏组相比),这些变化一直保持至快速起搏后6 h;起搏组的AERP频率适应性下降,起搏前AERP130较AERP200缩短(11.88±15.57)ms,起搏后6 h只缩短(4.38±5.63)ms.而cariporide组的AERP频率适应性则未发生显著变化.起搏组右心耳组织的NHE-1含量显著少于对照组(P<0.05),cari-poride组的右心耳组织NHE-1含量与对照组差异不显著.结论:Cariporide可有效阻止快速心房起搏引起的AERP缩短,但不影响起搏引起的NHE-1含量的下降.
关键词： 心房颤动 钠氢反向转运物 Cariporide
