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胰高血糖素样肽-1对晚期糖基化终末产物诱导的ECV-304细胞核转录因子-κB、血管细胞黏附分子-1表达的影响
目的 本实验观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对晚期糖基化终末产物(AGEs)损伤的ECV-304细胞的细胞活性、核转录因子-κB(NF-κB)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响.方法 人工制备AGEs.培养ECV-304细胞至80%满瓶后分组:对照组(5.5mmol/L葡萄糖DMEM8h);AGEs组[5.5mmol/L葡萄糖DMEM+50μg/ml AGEs-人血清白蛋白(HAS)8h];加药组1(0.03nmol/ml GLP-1+5.5mmol/L葡萄糖DMEM8h);加药组2(0.03 nmol/ml GLP-1 +5.5 mmol/L 葡萄糖DMEM +50 μg/ml AGEs-HAS 8 h).使用MTT 法检测细胞活性,用ELISA 试剂盒检测细胞培养上清液NF-κB、VCAM-1 的表达量.结果 (1) AGEs 组与对照组相比,细胞活性下降、NF-κB 和VCAM-1 的表达量明显升高(P ＜0.05).(2)0.03 nmol/ml GLP-1 和AGEs-HAS共同干预与单用AGEs-HAS干预的组别相比,前者细胞活性升高、NF-κB和VCAM-1的表达量明显减少(P＜0.05).结论 GLP-1能抑制AGEs对ECV-304细胞的损伤,提示具有保护AGEs诱导的损伤血管内皮细胞功能的作用,其机制可能是通过下调NF-κB来实现的.
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同型半胱氨酸硫内酯对ECV-304细胞凋亡及ROS生成的影响
目的探讨同型半胱氨酸硫内酯(HcyT)对人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)的损伤作用及其可能机制.方法采用倒置显微镜、四唑盐(MTT)比色法及碘化吡啶(PI)染色流式细胞仪检测HcyT对细胞毒性作用,以荧光标记流式细胞仪检测细胞内反应性氧类(ROS)的生成.结果一定剂量HcyT刺激后,内皮细胞发生凋亡,且凋亡呈浓度时间依赖性.随着HcyT浓度的增加,ROS的生成逐渐增加.结论HcyT通过ROS呈时间浓度依赖性地诱导内皮细胞凋亡,这可能是Hcy致血管病变的机制之一.
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熊果苷拮抗H2O2损伤的研究
目的通过体外细胞学实验观察熊果苷拮抗H2O2的作用.方法体外培养人脐静脉内皮细胞ECV-304,将细胞分为对照组、损伤组和熊果苷组,熊果苷组提前12h加入熊果苷,500μmol/L H2O2诱导细胞氧化应激状态.光镜实验比较各组细胞形态学的变化;MTT实验比较各组细胞增殖活力的改变.结果光镜下可见,对照组细胞结构清晰,呈单层铺路石状紧密排列;损伤组细胞变形、皱缩、排列紊乱、脱落明显,胞浆内出现空泡;熊果苷组细胞形态结构基本清晰,但细胞有轻度肿胀,其它接近于正常对照组;MTT结果显示,与损伤组相比,熊果苷能明显保护ECV-304细胞增殖活力(P<0.05).结论本实验结果提示,熊果苷可以抵御H2O2所致ECV-304细胞氧化应激损伤.
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瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响
目的研究瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响,并为后续动物实验探索佳体内转染DNA-脂质体比例.方法以不同比例之质粒DNA-Lipofectamine 2000转染肝癌细胞系HepG-2细胞,瞬时转染经RT-PCR证实目的基因已转入细胞内48 h后收集上清,上清液与血管内皮细胞以划痕法共培养,计算迁移率.结果不同比例转染细胞的上清液均可抑制内皮细胞的迁移,以DNA-脂质体比例1:1,抑制率高.结论瞬时转染Arresten基因可抑制血管内皮细胞的迁移,并为后续动物实验奠定一定的基础.
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瘦素(leptin)对ECV-304细胞氧化应激的保护作用
目的:研究外源性瘦素(leptin)在细胞氧化应激中对细胞存活率的影响,探讨leptin在抗氧化应激方面的作用.方法:利用H2O2诱导人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞建立细胞氧化应激模型,设立正常对照、单纯损伤和不同浓度leptin干预组,每组7例,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率;比色法测定细胞上清液中丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量.结果:与正常对照组相比,加入外源性leptin的三组正常ECV-304细胞存活率无显著变化,但25μg/L leptin组有升高的趋势,100μg/L leptin组有降低的趋势.与单纯损伤组相比,加入外源性leptin的三组损伤ECV-304细胞存活率显著升高(P均＜0.05).与单纯损伤组相比,加入外源性leptin的三组ECV-304细胞上清液中MDA生成量和LDH释放量显著下降(P均＜0.05).结论:leptin对ECV-304细胞的氧化应激具有剂量依赖性的保护作用.
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低浓度长春花碱对ECV-304细胞迁移及管样结构生成的影响
目的 研究在体外培养中低浓度长春花碱(VBL)对ECV-304细胞的迁移及管样结构生成的影响.方法 分别用改良的Boyden室迁移测试法和Matrigel上血管新生的短期二维培养模型来评价低剂量VBL对ECV-304细胞迁移及管样结构生成的作用.结果 ECV-304细胞经0.1、2.5、5.0和10.0 μg/L VBL预处理24 h后,其迁移抑制率分别为39.8%、56.9%、80.5%和97.2%,与对照组比较有显著差异(P＜0.01);在Matrigel上形成管样结构数量逐渐减少,结构逐渐破坏,呈剂量依赖关系.结论 低浓度VBL能有效抑制ECV-304细胞的迁移及管样结构生成.
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用Millicell底膜培养皿研究Tourmaline对ECV-304细胞增殖的影响
目的用联合培养的方法研究Tourmaline对体外培养的人血管内皮细胞(ECV-304)增殖作用的影响.方法用放置Tourmaline微球的Millicell底膜培养皿与人血管内皮细胞ECV304联合培养.通过细胞形态、细胞融合面积、细胞计数及增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫细胞化学等方法观察培养细胞增殖的变化.结果联合培养24h后Tourmaline组(与对照组比)细胞形态正常,呈铺路石样生长,贴壁细胞覆盖率从(79.50±5.92)%长到(90.17±3.49)%(P＜0.05),细胞数增加(16.62±4.14)%(P＜0.05),PCNA阳性细胞为(43.50±3.19)%,与对照组比,差异均有非常显著意义(P＜0.01).结论Tourmaline可通过加强DNA合成,促进体外培养的ECV-304细胞增殖.
关键词： 联合培养 Tourmaline ECV-304细胞 -
卡维地洛对过氧化氢致血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用
目的观察卡维地洛(carvedilol)对过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)致内皮细胞损伤及表面粘附分子表达的影响.方法采用H2O2作为外源性自由基生成系统,模拟内皮细胞的脂质过氧化损伤,建立离体培养的ECV-304细胞氧化应激损伤模型,观察卡维地洛对H2O2致内皮细胞损伤及表面粘附分子表达的影响.结果卡维地洛各浓度组均明显改善H2O2(1.0×10-6mol·L-1)所致ECV-304细胞形态学损伤,提高细胞生存率,降低LDH释放,并可使细胞内及细胞培养液中MDA含量降低,SOD活性升高,亦可下调ICAM-1蛋白及细胞内ICAM-1mRNA表达水平,上述作用随药物浓度增加呈增强趋势.结论卡维地洛可保护内皮细胞结构和功能的完整性,提高内皮细胞抗氧化能力,并从转录水平抑制脂质过氧化诱导的粘附分子表达增加,降低单核-内皮细胞粘附,有利于减少动脉粥样硬化的始动环节和早期事件的发生.
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同型半胱氨酸诱导内皮细胞炎症损伤及金雀异黄酮的保护作用机制探讨
目的:探讨金雀异黄酮(genistein,GEN)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的内皮细胞毒性和炎症的抑制作用及其分子机制.方法:采用MTT法检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测相关炎症分子白细胞介素-6(IL-6)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1).结果:单独加5.0 mmol/L的Hcy组活力差,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).显微镜下见对照组细胞呈单层鹅卵石样紧密排列,细胞状态良好,而Hcy 5.0 mmol/L组细胞排列杂乱,凋亡增多,状态也差.ELISA结果发现,与对照组比较,5.0 mmol/L的Hcy能显著增强 IL-6及ICAM-1表达(P<0.01).然而GEN(10、50、100 靘ol/L)能够增强细胞活力,显著抑制由Hcy介导的IL-6及ICAM-1表达的增强,大大改善细胞状态,尤其是100 靘ol/L的GEN(P<0.01).结论:GEN对 Hcy介导的内皮细胞毒性及炎症反应有明显的抑制作用.
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同型半胱氨酸对ECV-304细胞NO和ROS形成的影响
目的:观察同型半胱氨酸(Hcy)对ECV-304细胞产生一氧化氮(NO)及其对细胞内活性氧(ROS)产生的影响.方法:将不同浓度的Hcy与ECV-304细胞体外共培养24 h,硝酸还原酶法检测3种一氧化氮合酶(NOS)激动剂前后各组NO含量;流式细胞术检测细胞荧光强度,以反映ROS水平.结果: 0.50、1.00 mmol/L Hcy作用24 h时NO量明显低于对照组(P<0.01);加入3种NOS激动剂刺激后,仍显示Hcy对ECV-304细胞释放NO反应的抑制作用,1.00 mmol/L Hcy组与对照组和低浓度组差异均有显著性(P<0.01).0.50、1.00 mmol/L Hcy组的荧光强度明显高于对照组和低浓度组(P<0.01).结论:Hcy可促进血管内皮细胞内ROS的产生,并抑制NO的形成,且呈剂量-效应关系.
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同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞株ECV-304生长的抑制作用
目的:观察同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞生长的影响,探讨高同型半胱氨酸血症(HHCY)致动脉粥样硬化(As)的机制.方法:将不同浓度Hcy与ECV-304细胞体外共培养不同时间,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞生长抑制率,3H-TdR掺入法检测细胞DNA合成.结果:显微镜见对照组细胞呈单层鹅卵石样紧密排列,而实验组随Hcy浓度的升高及作用时间的延长,细胞排列杂乱,聚集成团.低浓度Hcy对细胞生长的抑制作用不明显,5.0、10.0 mmol/L Hcy对细胞生长呈现抑制作用,且两组浓度作用72 h的生长抑制率高于作用48 h(P<0.01).5.0、10.0 mmol/L Hcy作用48 h、72 h,3H-TdR掺入抑制率高于相应对照组和低浓度组,且作用72 h的掺入抑制率显著高于48 h(P<0.01).结论:Hcy对VEC具有直接损伤作用,可以时间及剂量依赖方式抑制ECV-304细胞的生长及DNA的合成.
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一氧化氮供体型沙利度胺衍生物WⅠ5对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮的影响
目的 本文观察了一氧化氮供体型沙利度胺衍生物WⅠ5对培养人脐静脉内皮细胞(ECV-304细胞)分泌一氧化氮以及形态学的影响.方法 用不同浓度的沙利度胺和WⅠ5作用于ECV-304细胞,采用NO测试盒测定细胞培养上清液的NO含量,间接反映细胞的NO生成量.结果 随着沙利度胺浓度增高,ECV-304细胞NO释放量逐渐减少,高浓度时NO释放量明显减少(P＜0.05);而随着WⅠ5浓度增高,ECV-304细胞NO释放量逐渐增加,高浓度时NO释放量极显著性增加(P＜0.01) .结论 显示一氧化氮具有促进细胞增殖和抑制细胞增殖的双重特性,其促进增殖和抑制增殖的作用很大程度上依赖于NO释放量的多少.
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川芎嗪二苯甲基哌嗪衍生物对ECV-304细胞氧化损伤的保护作用
目的:研究川芎嗪二苯甲基哌嗪衍生物对ECV-304细胞氧化损伤的保护作用.方法:用过氧化氢致ECV-304细胞损伤,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活数量.结果:川芎嗪二苯甲基哌嗪衍生物具有对ECV-304细胞氧化损伤的保护作用,其活性比川芎嗪强.结论:川芎嗪二苯甲基哌嗪衍生物具有对ECV-304细胞氧化损伤的保护作用.
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蒿甲醚对体外培养SGC-7901细胞及ECV-304细胞增殖及细胞周期的影响
目的:观察中药蒿甲醚对体外培养SGC-7901细胞及ECV-304细胞增殖及细胞周期的影响.方法:取对数生长期的SGC-7901细胞配制成5 × 104 mL-1.的单细胞悬液,接种于96孔板,培养24 h,加入不同浓度(1000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L)的蒿甲醚,以生理盐水为空白对照,继续培养48 h,采用MTT法测定SGC-7901细胞的生长抑制率和IC50,并以人脐静脉内皮细胞ECV-304作对照.应用流式细胞仪分析500 mg/L蒿甲醚作用24、48、60、72、84 h后细胞凋亡率和细胞周期变化.结果:随着药物浓度的增加和作用时间的延长,蒿甲醚对SGC-7901和ECV-304细胞的生长抑制作用具有时间和剂量依赖性(P<0.05).蒿甲醚作用于SGC-7901、ECV-304细胞24、48、72 h的,IC50分别为(504.74 ± 3.87)、(130.46 ± 3.12)、(83.46 ± 2.92)和>1000、>1000、(384.42 ± 13.74) mg/L,2种细胞间比较差异均有统计学意义(P均<0.05).流式细胞术结果显示SGC-7901细胞出现明显的凋亡峰,随着作用时问的延长,其凋亡率逐渐升高(P<0.05),细胞周期S及G2/M期细胞放大量减少,细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05).结论:蒿甲醚具有诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的作用.
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NDGA对内皮细胞增殖抑制的作用研究
目的:探讨去甲二氢愈创木酸(NDGA)对内皮细胞增殖活性的影响及特点.方法:采用形态学观察、细胞计数、流式细胞仪分析、免疫组织化学等技术方法观测不同浓度NDGA作用下人脐静脉内皮细胞ECV-304细胞增殖活性的变化.结果:1不同浓度(50～200 μmol/L)的NDGA处理ECV-304细胞24～72 h后或一定浓度(100 μmol/L)的NDGA处理ECV-304细胞不同时间(1～8 d)后,均出现NDGA抑制细胞增殖的作用,且这种作用与NDGA的浓度和作用时间有关.2NDGA处理细胞后出现细胞增殖活性降低,主要表现为有丝分裂计数和细胞增殖指数降低,细胞的生长抑制率增加,细胞生长减慢,免疫组化显示PCNA、BrdU标记指数下降等.结论:NDGA对内皮细胞增殖有明显抑制作用,此抑制作用可能是其影响血管生成的主要原因之一.
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缺氧对ECV-304细胞CASK表达及细胞内分布的影响
目的 了解缺氧后ECV-304细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase, CASK)蛋白表达及细胞内分布的变化.方法 将培养的ECV-304细胞置于缺氧(5%O2) 条件培养1、3、6、12 h,用Western blot方法检测CASK表达的变化,用免疫组化技术观察CASK在细胞内分布情况.结果 ECV-304细胞的CASK表达随缺氧时间延长而逐渐增高,3 h开始增加,6 h达高峰,12 h下降但仍高于正常.免疫组织化学染色的结果显示,随着缺氧时间的延长,细胞染色加深、并出现CASK向核膜聚集的现象.结论 缺氧可以影响CASK的蛋白表达和细胞内分布,提示CASK可能是一个新的值得关注的缺氧相关蛋白.
关键词： 缺氧 钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶 ECV-304细胞 -
土大黄提取物中蒽醌类成分的含量测定及其对ECV-304细胞的增值作用
目的:探讨土大黄不同乙醇提取物对ECV-304细胞的生长抑制作用.方法:采用HPLC法测定土大黄提取物中蒽醌类成分的含量;采用培养的ECV-304细胞,应用MTr比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化.结果:土大黄95％乙醇提取物总蒽醌成分可充分提取;在0.025～ 10 μg/ml范围内,除水提物外均能明显抑制ECV-304细胞的增值.结论:土大黄95％乙醇提取物中蒽醌类成分的含量及其对ECV-304细胞的抗增殖作用明显优于其他提取物.
关键词： 土大黄 蒽醌类成分 ECV-304细胞 四甲基偶氮唑蓝比色法 细胞抑制 -
人类14-3-3β真核表达系统的构建
目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达.方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达.结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础.
