血小板CD36新等位基因1142T>G序列分析及确认

背景：作为血小板上的主要抗原之一，CD36抗原又被称为血小板糖蛋白Ⅳ，其基因变异会导致 CD36抗原缺失。
　　目的：序列分析并确认1例CD36抗原新等位基因。
　　方法：提取外周血样本DNA，应用聚合酶链式反应扩增CD36基因的12个编码区序列片段，应用直接测序法对目的片段的序列进行检测。所得序列与基因库中编号为 NG_008192的标准序列进行比对分析，以确定新的基因突变。
　　结果与结论：被检样本在第12外显子的1142位发生T>G的碱基突变，其他外显子序列与标准序列一致。检索国际基因数据库GenBank和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，均未发现关于1142 T>G突变的数据和报道，因此为国际上首次确认，上报GenBank获得登录号：KM275213。1142 T>G突变导致第381位氨基酸由亮氨酸(Leu，L)改变为丝氨酸(Ser，S)，两者在亲/疏水性和极性上差异较大，且381位氨基酸所在区域为高度保守区域，因此推测该突变会使蛋白活性降低甚至消失。

新等位基因HLA-A*24：233与HLA-A*26：89的分析确认

背景：分子生物学新技术的发展和大量应用加快了中国发现HLA 新等位基因的步伐。新等位基因的发现不仅给HLA家族增加了新成员，同时也为研究民族或地区的优势基因或消失基因(不适合客观环境的基因)找到了突破点。目的：确认2个新的HLA等位基因，并分析其核苷酸序列。方法：应用PCR-SBT、GSSP测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行HLA高分辨分型，发现2个样本HLA-A位点均为异常基因，与已知同源性高的等位基因型进行序列比对，分析核苷酸序列的差异。结果与结论：2个样本HLA-A位点与目前已知的相应HLA-A等位基因序列均不一致，样本1与其同源性高的A*24：02：01的差异表现在第3外显子区域中的第360位碱基由G > C，导致第96位密码子由谷氨酰胺变为组氨酸，样本2与其同源性高的A*26：01：01比较差异表现在第2外显子区域中第97位碱基由T>C，导致编码的第9位密码子由酪氨酸变为组氨酸。结果表明两个样本为 HLA-A 位点的新等位基因，已提交GenBank进行注册，并已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*24：233与HLA-A*26：89。

新等位基因HLA-B*5812的认定

应用流式反向PCR-SSO和PCR-SSP基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行HLA基因分型、DNA序列分析及克隆测序.发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性高的等位基因B*5801的差异在于第2外显子区域中的第69位碱基发生了G→T的替换,即"GCA→TCA",结果改变了第24位密码子编码的氨基酸,即"丙氨酸→丝氨酸".判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,已于2006年4月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*5812.

新等位基因HLA－A?01∶130的序列分析及HLA分子三维结构模拟

目的：确认HLA新等位基因HLA－A?01∶130并分析其有异常反应格局的核苷酸序列。方法：应用DNA测序分型技术（ PCR－SBT）进行HLA分型，对可疑新等位基因采用单链测序基因分型技术直接测定基因序列，分析其与同源性高的HLA等位基因序列的差异。后，经Swiss－Model对HLA分子进行三维结构模拟。结果：新基因与所有已知的HLA－A等位基因序列均不相同，与HLA－A?01∶66基因序列相比在第3外显子368位碱基由A→G，导致第99位密码子改变，酪氨酸→半胱氨酸。替代氨基酸位于抗原肽结合区β片层上。结论：发现一个新的HLA－A等位基因，现已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA－A?01∶130。

人类白细胞抗原新等位基因A*24:257序列及其编码蛋白分子三维结构模拟分析

目的 鉴定分析人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因A*24:257的序列变异及其氨基酸残基改变在其编码蛋白分子三维空间结构中的位置及影响.方法 应用PCR-SBT测序分型技术发现1例等位基因结果 异常样本,采用单等位基因特异性测序进行鉴定.应用Phyre2蛋白折叠识别在线建模服务器以及RasMol和PDB Protein Workshop分析软件,对其编码蛋白分子三级结构及其氨基酸残基改变特点在MHC分子三维空间结构中所处位置及可能影响进行模拟分析.结果样本A*24:198等位基因第2外显子第155位核苷酸碱基发生了T->A碱基替代.导致相应的第28位密码子由GTG→GAG.其编码氨基酸由缬氨酸(Val,V)变为谷氨酸(Glu,E).与A*24:02:01相比,A*24:257第28位编码氨基酸由中性缬氨酸(V)→酸性谷氨酸(E),第29位由酸性天冬氨酸(D)→中性天冬酰胺(N).其编码蛋白分子三级结构建模分析表明,该氨基酸变异位置位于 α1结构域β折叠片层底面的外侧第3β股链近转角处,接近抗原多肽结合槽中心外缘区域.结论 该等位基因序列被WHO HLA因子命名委员会正式命名A*24:257.分析预测其编码氨基酸改变将可能影响A*02:257分子的抗原多肽结合及呈递功能.

025原发性胆汁性肝硬化中人类NRAMP1基因启动子区多态性微卫星重复区新等位基因的鉴定

HLA新等位基因B*4086的确认及家系调查

目的 识别和鉴定HLA新等位基因B*4086,调查分析该基因的遗传情况.方法 应用聚合酶反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-sequence specific oligonucleotide primer,PCR-SSOP)技术对中华骨髓库志愿捐献者血样进行HLA分型,发现1例HLA-B疑似新等位基因,用DNA测序技术鉴定新等位基因并对该基因的携带者进行家系调查.结果 经DNA测序确定为HLA新基因序列,该基因与 HLA-B*40060101相比,第3外显子419位碱基由A→T,导致相应的140位密码子编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)→苯丙氨酸(Phe).家系分析表明该新基因来自携带者母亲一方.结论 DNA测序表明被测样本含有HLA-B新等位基因,于2008年2月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4086,该新基因遗传于先证者母亲.

新等位基因HLA-B*0740,DRB1*1609,DRB1*1449的血清学表型

目的:确认新等位基因HLA-B*0740、DRB1*1449;DRB1*1609的血清学表型.方法:应用标准NIH微量淋巴细胞毒试验进行新等位基因血清学分型.结果:新等位基因HLA-B*0740、DRB1*1449、DRB1*1609的核苷酸序列与它们相应的同源等位基因不同,造成相应编码氨基酸残基差异,但是它们的血清学特异性仍为B7、DR14和DR16.结论:上述HLA新等位基因具有免疫学表型.

HLA-B新等位基因B*51:02:03的确认和分析

人类白细胞抗原系统(HLA)在造血干细胞和器官移植中具有重要意义,供受者HLA相合程度与移植后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率以及移植物的存活率等密切相关[1-2],目前已有多个国家建立造血干细胞捐献者资料库,作为临床患者造血干细胞移植的供者来源.笔者近期在常规的造血干细胞捐献者标本分型中,采用Luminex PCR-SSO分型方法发现1例HLA-B疑难分型标本,进而测序分析发现其为新的等位基因,被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*51:02:03,现将结果报道如下.

HLA新等位基因HLA-B*35∶155的确认

目的 发现和认定一个人类白细胞抗原(HLA)新等位基因.方法 应用多聚酶链式反应-基于测序的分型技术(polymerase chain reaction-sequence based typing,PCR-SBT)进行HLA常规分型,HLA-B位点分型结果与等位基因B*35∶03∶01,51∶01∶01在112位有一个碱基不匹配,不能指定为任何HLA-B位点等位基因,用针对于B* 35、B*51的序列特异性SSSP引物测序,确认与同源性高的HLA等位基因序列的差异.结果 测序结果表明该等位基因与其同源性高的等位基因B*35∶03∶01的差异是在第2外显子112位的C＞T,其突变导致密码子CGG＞TGG,结果造成B*35∶03∶01氨基酸序列中14位的精氨酸(R)变为色氨酸(W).结论 该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会将其正式命名为HLA-B* 35∶155.

HLA新等位基因HLA-A*1127认定

目的 发现和认定HLA新等位基因HLA-A*1127.方法 应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因.采用分子克隆和PCR产物直接测序方法得到核苷酸序列,通过软件分析基因序列及其与同源HLA等位基因序列的差异.结果 发现1个样品的HLA-A位点结果异常.其序列与已知所有HLA-A等位基因序列不一致,与同源性高的等位基因A*1104的差异是在第三外显子区域的570位碱基发生G→C的替换.并导致了相应的166密码子由GAG→GAC,编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变成天冬氨酸(Asp);571位碱基发生T→G的替换,并导致相应的167密码子由TGG→GGG,编码的氨基酸由色氨酸(Trp)变成甘氨酸(Gly).结论 该等位基因为HLA新的等位基因,被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*1127.

HLA新等位基因HLA-B*67:07测序分析及确认

目的 人类白细胞抗原B新等位基因核苷酸序列分析及确认.方法 采用序列特异性寡核苷酸探针技术(SSO)对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)入库数据进行HLA常规检测,结果显示有1个磁珠反应异常,进一步选择多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)分型发现1个与HLA-B*67相关的有1个碱基不匹配的等位基因,选择对应的组特异性引物对该等位基因进行2次分离式测序,确认突变的等位基因和突变位点.结果 发现1个与HLA-B*67:01:01序列相近的新等位基因,实验结果表明在HLA-B*67:0:01第3外显子370位置G>A,其突变造成HLA-B*67:01:01氨基酸序列中100位的氨基端由甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser).结论 本次实验确认了1个新的HLA等位基因,2016年3月30日被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*67:07.

1例HLA新等位基因B*15：201*的发现及确认

目的：1个人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）新等位基因的认定和序列分析。方法应用多聚酶链式反应—基于测序的分型技术（polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT）对中国造血干细胞捐献者资料库河北分库捐献者进行HLA高分辨率分型，发现1个HLA-B位点的异常结果，应用序列特异性测序引物（sequence specific sequencing primer，SSSP）分离测序，确认发生突变的等位基因及发生突变的位置。结果发现1例标本的HLA-B位点分型结果不能认定为任何已知结果，利用SSSP引物进行分离测序后发现1条链的等位基因核苷酸序列与所有已知HLA-B位点等位基因核苷酸序列不一致，与同源性高的等位基因B*15：01：01：01的差异是在第2外显子662位的A＞T，其突变导致密码子CAT＞CTT，结果造成B*15：01：01：01氨基酸序列中221位的组氨酸（H）变为亮氨酸（L）。结论该等位基因为HLA-B位点的1个新等位基因，被世界卫生组织（WHO）HLA系统命名委员会命名为HLA-B*15：201。

1例新等位基因HLA-DRB1*0918的筛查及序列分析

目的：了解和确认人类白细胞抗原（HLA）新等位基因并分析其核苷酸序列。方法采用聚合酶链反应-直接测序技术（PCR-SBT）方法对岳阳地区7500名造血干细胞捐献志愿者进行HLA-DRB1高分辨率分型，发现1个与HLA-DRB1*09：01：02序列相近的新等位基因，采用针对DRB1*09位点特异性SSP引物测序，确认该等位基因与DRB1*09：01：02序列的差异。结果该基因与DRB1*09：01：02相比在第2外显子276位C＞A，其突变导致密码子AGC＞AGA，63位S（丝氨酸）＞R（精氨酸），该基因序列已提交GenBank，编号为1523488。结论该等位基因经过核苷酸序列分析得出其为新的HLA-DRB1等位基因，该基因已于2013年5月22日被世界卫生组织（WHO）HLA命名委员会命名为HLA-DRB1*09：18。

HLA新等位基因A*110202的发现

目的:用DNA测序的方法确定HLA新等位基因.方法:用SSO流式荧光微珠技术(LABMAS)进行常规HLA-A、B、DRB1中低分辨检测,用DNA 测序的方法鉴定HLA*A新等位基因.结果:应用3种常规的HLA检测试剂检测该标本,均无法得到确切的A位点的结果,合成特异性引物对A位点2、3外显子进行扩增测序,发现在HLA*A 的2外显子区域出现295 C＞A,该改变不引起氨基酸变化,无新的抗原产生.结论:该新的基因经WHO HLA因子命名委员会(IMGT)注册确认为A*110202,注册号为HWS 10003507-DQ354441.

MICA新等位基因MICA?008：05的DNA序列鉴定及分析

目的：采用直接测序法及克隆测序法确认新等位基因 MICA?008：05。方法采用 Sequence Base Typing （ SBT）法分型技术对MICA的多态性进行常规基因分型，采用克隆测序法进行确认并与已知的等位基因序列进行比对。结果发现1个样本在外显子3上有1个碱基位置与国际通用MICA数据库不相符。该基因与MICA?008：01：01相比在外显子3的碱基位置591出现突变（ C→T），密码子位置174由TCC→TCT，相应编码氨基酸是同义突变。结论 DNA测序结果表明该基因序列为新的MICA等位基因，已提交GenBank，并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为MICA?008：05。

HLA新等位基因B*15∶202的确认和序列分析

目的:确认1个人类白细胞抗原(HLA)新等位基因.方法:应用多聚酶链反应-基于测序的分型技术(PCR-SBT)法对中华骨髓库河北地区捐献者进行HLA常规分型并利用序列特异性SSSP引物测序,鉴定HLA新等位基因.结果:发现该标本的HLA-B位点核苷酸序列与所有已知HLA-B位点等位基因核苷酸序列不一致,不能指定为任何等位基因,其中一个等位基因与同源性高的等位基因B*15∶01∶01∶01的差异是在第2外显子206位的T＞C,其突变导致密码子ATG＞ ACG,结果造成B*15∶01∶01∶01氨基酸序列中45位的甲硫氨酸(M)变为苏氨酸(T).结论:该等位基因为HLA-B位点的1个新等位基因,该基因被世界卫生组织HLA命名委员会命名为HLA-B* 15∶202.

中国南方汉族人群KIR2DS4基因的多态性

目的 探讨南方汉族人群KIR2DS4分子遗传多态性.方法 应用特异性PCR引物扩增306名无关个体KIR2DS4基因的全部外显子,确定KIR2DS4框架基因的有无.对存在KIR2DS4的样本,对该基因的全部外显子进行双向测序,用Assign 3.5分析软件鉴定基因型.在测序分型中出现与国际IPD-KIR数据库不完全匹配结果的样本,进行cDNA分子克隆和单倍型测序.结果 306名南方汉族无关个体中,携带KIR2DS4基因的个体为297例,经测序分型,均获得了清晰的序列峰图.共检出了7种等位基因,其中3个新等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名.检出的等位基因及其频率分别为KIR2DS4* 00101(78.8％)、*003 (10.5％)、*004 (16.0％)、*010 (23.2％)、*017(0.3％)、* 00105(0.3％)和*018(0.7％),未检出KIR2DS4* 007等位基因.能正常表达于细胞表面的等位基因(KIR2DS4* 00101、*017、*00105)和不能正常表达于细胞表面的等位基因(KIR2DS4* 003、*004、*010、*018)的检出比例分别为79.4％及50.4％,约为1.6∶1.结论 获得了南方汉族人群KIR2DS4等位基因分子遗传多态性,可为移植、疾病关联研究及人类进化等提供基础数据.

两个新的RHD等位基因的分子研究及家系分析

目的 对新发现的2个RHD等位基因进行分型,并对其家系成员进行分型研究.方法 应用单克隆抗体检测Rh血型抗原.对新发现的等位基因再用基因分型技术检测RHD基因型,扩增先证者及家系成员RHD基因10个外显子,作直接测序分析；并用序列特异性引物聚合酶链反应(sequence specific primer-polymerase chain reaction,PCR-SSP)技术检测先证者2的家系成员.结果 2例先证者均为RhD阴性.先证者1测序分析显示为RHD 78 del C,家系调查发现先证者1妹妹的Rh表现型和测序结果与先证者一致；先证者2测序分析为第4外显子520G/A,第8外显子1080始缺失10个碱基,家系调查的测序结果显示先证者的RHD 520 G＞A+1080 del 10基因来源于母亲.2个新的等位基因(RHD 78delC、RHD 520 G＞A+1080 del 10)已被GenBank受理(GQ477180、GU362076).结论 这两个新发现的RHD等位基因为RHD假基因,家系调查显示均可以稳定遗传.

新等位基因HLA-B*40:96的确认及家系遗传

目的 鉴定一个中国汉族人群中发现的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因,调查该基因的家系遗传情况.方法 应用Luminex DNA杂交流式分型技术进行HLA分型,发现1例HLA-B位点反应格局异常,采用DNA测序分型技术进行新等位基因鉴定并对该基因的先证者进行家系调查.结果 DNA序列确定为一个新HLA-B等位基因序列,与同源性高的HLA-B* 40:06:01相比,在第2外显子有7个碱基不同,分别是302位G→A、309位G→C、311位A→C、313位C→G、314位T→C、317位G→T、319位G→C,并导致相应密码子编码的氨基酸发生了改变,密码子101位由丝氨酸(Ser)→天冬氨酸(Asn)、104位由天冬氨酸(Asn)→苏氨酸(Thr)、105位由亮氨酸(Leu)→丙氨酸(Ala)、106位由精氨酸(Arg)→亮氨酸(Leu)、107位由甘氨酸(Gly)→精氨酸(Arg).家系分析表明该新基因来自先证者父亲.结论 鉴定了一个HLA-B新等位基因,2009年2月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B* 40:96.