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羧胺三唑在BV2细胞模型中的抗炎作用
目的 探讨羧胺三唑(CAI)对BV2细胞模型中多种炎性细胞因子的调节作用.方法 将不同浓度的CAI加入BV2细胞中培养18 h后,用CCK-8法测定其细胞数.分别用ELISA试剂盒和硝酸盐还原法测定细胞培养基上清中的TNF-a、IL-IB、IL-6、NO的含量,用荧光定量PCR法测定BV2细胞中TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA的含量.结果 与对照组相比,CAI浓度在20、30、40μmol/L能够剂量依赖性抑制BV2细胞TNF-α的分泌[(359.4±12.9)vs(241.6±16.1),(135.7±6.4),(5.3±1.9)pg/mL,P<0.01],也可显著抑制IL1β、NO、IL-6的分泌(P<0.01),同时也能够降低TNF-α、IL-1β、COX-2和iNOS的mRNA的表达(P<0.01).结论 CAI能够明显降低在ALS的BV2细胞模型中炎性介质TNF-α、IL-1β、NO、IL-6的分泌以及TNF-α、IL-1β、COC-2和iNOS的mRNA的表达,对小胶质细胞的活化及其炎性反应有明显的抑制作用.
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羧胺三唑抑制佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子
目的 探讨羧胺三唑(CAI)体外对佐剂性关节炎(AA)大鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子的影响.方法 采用弗氏完全佐剂诱导大鼠AA模型,无菌制备大鼠腹腔巨噬细胞,加CAI(10、20和40 μmol/L)体外培养;ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量;荧光定量PCR法检测细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达;TransAM试剂盒检测核蛋白NF-κB p65的DNA结合活性.结果 CAI(20、40 μmol/L)能够明显降低AA大鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平,减少细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达,同时也能够抑制核内NF-κB p65的DNA结合活性(P<0.05,P<0.01).结论 CAI可能通过抑制NF-κB的活性而减少AA大鼠腹腔巨噬细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的产生,CAI的抗关节炎作用可能与上述机制有关.
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羧胺三唑对RBL-2H3细胞活化脱颗粒的影响
目的研究羧胺三唑(CAI)对RBL-2H3肥大细胞增殖、凋亡及活化脱颗粒的影响,探索CAI的抗感染作用机制.方法以C48/80诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒模型,中性红染色法观察细胞脱颗粒的形态学,分别用ELISA法和底物显色法检测细胞培养上清中组胺和β-氨基己糖苷酶的释放水平,CCK-8法测定细胞活力,Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡.结果与对照组相比,10、20和40 μmol/L CAI能够不同程度抑制C48/80诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒反应,20和40 μmol/L CAI能够降低C48/80诱导的组胺释放(P<0.01),40 μmol/L CAI能够降低β-氨基己糖苷酶的释放(P<0.01).另外,所用各浓度的CAI对细胞增殖和凋亡均无明显影响.结论CAI能有效抑制RBL-2H3肥大细胞的活化脱颗粒,此作用并不是通过细胞毒发挥作用的.CAI可能部分通过下调肥大细胞的功能活化,发挥其抗感染作用.
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羧胺三唑抑制肿瘤细胞诱导的巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α的释放
目的观察体外培养的肿瘤细胞对巨噬细胞炎症因子--肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的诱导作用；初步探索羧胺三唑（CAI）对肿瘤诱导的巨噬细胞中 TNF-α释放的影响。方法利用 transwell 装置，建立 Lewis 肺癌细胞（LLC）与 RAW264.7巨噬细胞共培养体系，采用荧光定量 PCR方法和 ELISA 方法分别分析 RAW264.7中 TNF-α的表达和释放；用 LLC 条件培养基（LCM）诱导 RAW264.7，同时给予 CAI 处理，采用 CCK-8方法分析 LCM 和 CAI对 RAW264.7活力的影响，采用 ELISA 方法分析 CAI 对诱导后的 RAW264.7中 TNF-α释放的影响。
结果与 LLC 共培养24 h 可显著增加 RAW264.7中TNF-α相对表达量[单独培养 vs 共培养，（1.00±0.12）vs （2.23±0.17），P <0.01]和释放[单独培养 vs 共培养，（65.21±12.76）vs （143.92±19.22）pg/ml，P<0.05]；LCM 和 CAI 在1 h 和4 h 对 RAW264.7活力没有影响，CAI 可以显著抑制 LCM 对 RAW264.7中 TNF-α释放的诱导（4 h，P<0.01）。
结论 LLC 肿瘤微环境可以诱导 RAW264.7中 TNF-α的表达增加；CAI 对这种诱导的抑制使其在肿瘤环境中表现出一定的抗炎作用，可能是其抗肿瘤作用的机制之一。 -
羧胺三唑联合地塞米松有效缓解小鼠过敏性气道炎症
目的 评价羧胺三唑(CAI)联合地塞米松对小鼠过敏性气道炎症的治疗效果,为哮喘性疾病探索安全、有效的联合用药方案.方法 将小鼠分为对照组、模型组、40 mg/kg CAI治疗组(CAI40)、低剂量地塞米松治疗组(DL)、高剂量地塞米松治疗组(DH)、低剂量地塞米松联合20 mg/kg CAI治疗组(DL20)、低剂量地塞米松联合40 mg/kg CAI治疗组(DL40).建立过敏性哮喘模型,取肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测其中IL-4、IL-13、IFN-γ 水平;计BALF中总细胞数和嗜酸性粒细胞数;ELISA法检测血清中IgE水平;取左肺切片,HE染色后观察肺组织病理水平改变.结果 与对照组相比,模型组小鼠呈现出明显的气道炎症反应,包括BALF中IL-4、IL-13水平及炎性细胞数明显升高,而IFN-γ 水平显著降低,血清中IgE水平显著升高,肺组织病理切片的HE染色结果呈现出明显的炎症细胞聚集浸润.与模型组相比,各治疗组均有缓解炎症的效果.联合用药组小鼠的BALF中IL-4、IL-13水平及炎性细胞数均低于CAI40组和DL组,而IFN-γ 水平高于三个单药治疗组.联合用药组血清中IgE水平均低于三个单药治疗组.肺组织病理结果显示,联合用药组的肺组织炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道平滑肌增厚等气道重塑程度均低于CAI40组和DL组,与DH组相当.结论 低剂量地塞米松联合低、高剂量羧胺三唑对卵清蛋白诱导的小鼠过敏性气道炎症有良好的治疗效果,比单药治疗组表现出更强的抗炎作用.因此,适当降低地塞米松剂量,通过联合羧胺三唑来治疗过敏性气道炎症,减少地塞米松耐药性和依赖性等不良反应,或可成为治疗过敏性气道炎的一种新方法.
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羧胺三唑抑制肺癌Lewis细胞生长的机制及抑瘤作用优化探索
目的 研究羧胺三唑(CAI)对小鼠肺癌Lewis细胞(LLC)中环腺苷酸(cAMP)相关磷酸二酯酶(PDE)活性的影响;研究腺苷酸环化酶激动剂Forskolin是否能增强CAI的抑瘤作用.方法 通过改良的Thompson和Appleman两步同位素法对LLC细胞中cAMP相关PDE的活性进行检测,以 PDE4 特异性抑制剂洛利普兰(Rol)作为 CAI 的阳性对照;通过台盼蓝斥染实验对LLC活细胞进行计数,检测Forskolin对CAI抑瘤作用的影响,以双丁酰环腺苷酸(db-cAMP)验证LLC细胞对cAMP含量增加的敏感性.结果 CAI可剂量依赖性地抑制LLC细胞中cAMP相关PDE的活性,CAI与Rol的IC50分别为5.62×10-6 mol/L和1.88×10-8 mol/L.Forskolin和db-cAMP均可剂量依赖性地抑制LLC细胞的活性.CAI与Forskolin合用的抑瘤作用显著优于CAI单用,CAI 5 μmol/L单用时的抑制率为(32.9±10.3)%,与Forskolin 10 μmol/L合用后抑制率可达(67.4±3.76)%(P<0.05).结论 抑制cAMP相关PDE的活性可能是CAI抑制LLC细胞活力的机制之一.通过与升高cAMP的药物如Forskolin合用,可进一步优化CAI的抗肿瘤作用.
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羧胺三唑对TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞增殖及MMP-1、MMP-3表达的影响
目的 研究羧胺三唑(CAI)对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖以及MMP-1、MMP-3表达的影响.方法 用弗氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎模型,并分离培养佐剂性关节炎大鼠的FLS.实验分为对照组,20 ng/ml TNF-α组,同时加入TNF-α和溶剂DMSO组,以及同时加入NF-α和不同浓度CAI(10、20、40 μmoL/L)组.CCK-8法检测FLS的增殖反应,Western blot法检测MMP-1和MMP-3的蛋白表达.结果 20 ng/mlNF-α能明显增加佐剂性关节炎大鼠FLS的增殖反应,增加MMP-1和MMP-3的蛋白表达(P＜0.01).CAI(20、40 μmol/L)能够显著抑制TNF-α对佐剂性关节炎大鼠FLS的促增殖反应(P＜0.01),抑制率分别为(31.13±7.07)％和(42.48±5.84)％,且CAI能够降低TNF-α诱导的MMP-1和MMP-3产生(P＜0.01).结论 CAI体外给药能够抑制TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠FLS增殖以及产生MMP-1和MMP-3,这可能是其抗关节炎作用的机制之一.
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羧胺三唑对脂多糖诱导的 RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响
目的研究羧胺三唑对脂多糖诱导的 RAW264.7细胞炎症模型中炎症因子的影响。方法脂多糖（1μg/ml）刺激生长良好的RAW264.7细胞，建立细胞炎症模型，并用不同浓度羧胺三唑处理。 CCK-8法检测羧胺三唑对RAW264.7细胞的毒性作用，ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，分光光度法检测一氧化氮（ NO）含量。结果羧胺三唑在2.5～40μmol/L的浓度范围内对RAW264.7细胞无毒性作用（P＞0.05）。脂多糖可以明显诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和NO（P＜0.01），10、20、40μmol/L的羧胺三唑能够显著抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α、IL-6和NO的水平（ P＜0.05和P＜0.01），20、40μmol/L的羧胺三唑能够抑制脂多糖诱导的IL-1β的释放（ P＜0.01）。结论羧胺三唑可以抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应，其抗炎作用与减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO有关。
关键词： 脂多糖类 一氧化氮 细胞因子类 羧胺三唑 RAW264.7细胞 -
羧胺三唑对肺腺癌细胞自噬的影响
目的观察羧胺三唑对肺腺癌细胞A549细胞自噬的影响，探究自噬调节在羧胺三唑抗肿瘤增殖作用中的角色。方法 SRB法测定羧胺三唑对A549细胞的体外增殖抑制作用，Logit软件计算半数抑制浓度（ IC50）；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术测定羧胺三唑给药48 h诱导A549细胞的凋亡率；Western blot检测羧胺三唑给药24 h后LC3-Ⅱ蛋白水平；EGFP-LC3质粒转染观察细胞自噬泡斑点情况；透射电子显微镜（ TEM）实验观察细胞自噬超微结构；采用溶酶体蛋白酶抑制剂评价羧胺三唑对自噬潮的影响；激光共聚焦显微镜结合MDC荧光染料观察细胞自噬溶酶体水平；流式细胞术结合MDC染色检测羧胺三唑对细胞自噬溶酶体的增加百分率。结果羧胺三唑剂量依赖性地和时间依赖性地抑制A549细胞增殖，72 h的IC50＝（13.81±1.15）μmol/L，83 h的IC50＝（5.86±1.06）μmol/L。羧胺三唑40μmol/L诱导A549细胞凋亡率为（18.7±1.9）％，P＜0.01。羧胺三唑能增加A549细胞LC3-Ⅱ蛋白表达水平，增加细胞EGFP＋-LC3亮点数目。电镜超微结构结果表明羧胺三唑作用24 h引起A549细胞自噬泡增多。在溶酶体蛋白酶抑制剂E64 d/pepstatinA存在下，羧胺三唑作用24 h未进一步升高LC3-Ⅱ蛋白水平。羧胺三唑作用A549细胞24 h显著增强自噬溶酶体水平（ P＜0.05）。结论羧胺三唑能够抑制A549细胞增殖，其作用机制可能与抑制A549细胞自噬体的降解有关。
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羧胺三唑通过肿瘤相关巨噬细胞间接抑制肿瘤细胞的迁移
目的：通过体外诱导探索肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对肿瘤细胞增殖和迁移的影响；在此基础上研究羧胺三唑（CAI）是否可以通过影响TAM及其来源的TNF-α间接抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。方法建立腹腔巨噬细胞或RAW264.7细胞与Lewis 肺癌细胞（LLC）的共培养体系，研究巨噬细胞对 LLC 细胞增殖和迁移的影响；观察TNF-α或其中和抗体对LLC增殖或迁移的影响；向共培养体系中加入CAI和（或）地塞米松（DEX），观察药物对巨噬细胞诱导的LLC增殖的影响；用CAI和（或）DEX预先处理RAW264.7细胞，然后检测不同药物处理组RAW264.7细胞诱导LLC细胞迁移和TNF-α表达的差异。结果与腹腔巨噬细胞共培养的 LLC细胞比单独培养的LLC细胞的增殖显著增加，在为明显的一组中，前者比后者的增殖增加（422.5±77.7）%；与 RAW264.7细胞共培养的 LLC 细胞比单独培养的 LLC 细胞迁移增加（98.8±6.2）%。在这两个过程中，TNF-α均发挥重要作用，0.1 ng/ml TNF-α增加LLC细胞增殖的作用显著，0.1μg/ml TNF-α中和抗体即可显著抑制巨噬细胞对LLC细胞的迁移诱导作用；CAI预处理的RAW264.7细胞促进LLC细胞迁移的能力减弱，其中TNF-α表达相比仅用LLC条件培养基诱导的对照组显著降低（CAI预处理组与对照组TNF-α的相对表达量为0.66±0.03 vs.1.00±0.05，P＜0.01）。结论巨噬细胞和TNF-α对LLC细胞的增殖和迁移有显著影响；CAI可以通过下调肿瘤条件诱导的巨噬细胞中的TNF-α水平间接抑制肿瘤细胞的迁移。
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羧胺三唑与SAHA联合用药抑制Lewis肺癌细胞的体内外研究Δ
目的：研究羧胺三唑（CAI）与组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）联合用药对Lewis肺癌细胞的抑制作用，对比联合用药与单药使用的药效差异。方法采用SRB法检测体外培养的Lewis肺癌细胞系在单独使用CAI或SAHA以及联合用药时的细胞活力变化；建立C57小鼠Lewis肺癌细胞皮下移植瘤模型，随机分为4组：溶剂对照组、CAI组、SAHA组、CAI+SAHA联合治疗组，连续给药25天，观察各组小鼠体质量变化、肿瘤体积、肿瘤抑制率及动物死亡情况。结果 CAI分别和两种剂量的SAHA联合用药后，对Lewis肺癌细胞活力的抑制作用高于CAI组，细胞活力的抑制率分别达到46.09%±5.50%和54.43%±3.69%，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。动物实验显示，与对照组相比，CAI组、SAHA组以及联合治疗组均抑制小鼠皮下肿瘤生长，且联合治疗组的肿瘤体积小于其他3组；除对照组外，各药物治疗组动物死亡率均低于20%。结论 SAHA与CAI联合使用能显著抑制Lewis肺癌细胞活力，并在Lewis肺癌细胞荷瘤动物中显现抗瘤增效作用。
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羧胺三唑胶丸Ⅰ期临床研究
目的:在晚期恶性肿瘤患者中观察羧胺三唑(CAI)胶丸的安全性、耐受性和药动学特点,确定大耐受剂量(MTD),为Ⅱ期临床研究确定合适的剂量.方法:本研究分为单次给药(n=12)和连续给药(n=18)试验两部分.进行了50,100,150和200 mg 4个剂量组的评估.单次给药者口服1次不同剂量的CAI胶丸后进行药动学研究;连续给药患者每天1次口服羧胺三唑胶丸,连续服用28 d为1周期,观察药物的耐受性,并进行连续给药药动学研究.结果:共20例晚期恶性肿瘤患者入选.恶心、呕吐是常见的不良反应,单次给药后4/12例患者发生了呕吐,与剂量关系不大.连续给药后11/18例发生了呕吐,与剂量相关.150 mg组7例患者中2例出现了剂量限制性毒性(DLT).轻到中度疲乏也较常见(11/18例).口服给药后血药浓度达峰时间约为2 h,平均清除半衰期为35～61 h,个体间血浆稳态谷浓度水平差别较大.结论:晚期恶性肿瘤患者对CAI胶丸的耐受性较好,MTD为100 mg·d-1,恶心、呕吐和疲乏为常见的不良反应.
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抗肿瘤药物羧胺三唑的抗炎镇痛作用
目的 探讨抗肿瘤药物羧胺三唑(CAI)是否具有抗炎镇痛作用并初步考察其作用机制.方法 采用巴豆油诱导小鼠耳肿胀模型、棉球肉芽肿模型和大鼠佐剂性关节炎模型评价CAI的抗炎作用.检测CAI对血管内皮生长因子(VEGF)或组胺诱导的小鼠背部皮肤局部血管通透性的影响,以及对炎症部位和血清中致炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)水平的影响.采用醋酸致小鼠扭体模型和福尔马林致痛模型评价CAI的镇痛作用.结果 CAI对急慢性炎症均有明显抑制作用,对VEGF或组胺诱导的血管通透性增加有明显缓解作用,对致炎细胞因子TNF-α和IL-1β有明显抑制作用.CAI对外周炎性疼痛也有明显治疗作用.结论 CAI是一种极具开发潜力的抗炎镇痛物质.
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羧胺三唑对博莱霉素致小鼠肺纤维化的治疗作用及其机制
目的 探讨羧胺三唑(CAI)对博莱霉素致小鼠肺纤维化的治疗作用,并探讨其可能的机制.方法 将45只小鼠按随机数字表法随机分为3组:(1)空白组:一次性尾静脉内注射生理盐水0.2 ml后,按0.1 ml/10 g给予聚乙二醇400溶液(PEG-400)灌胃,1次/d,连续14 d;(2)博莱霉素组:一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg,后按0.1 ml/10 g给予PEG-400溶液灌胃,1次/d,连续14 d;(3)羧胺三唑组:一次性尾静脉内注射博莱霉素150 mg/kg,后给予羧胺三唑溶液40 mg/kg灌胃,1次/d,连续14 d.观察28 d,内容包括:肺系数、生存分析、肺组织病理切片和胶原染色、肺组织羟脯氨酸含量以及肺组织匀浆中转化生长因子β1(TGF-β1)、γ干扰素(IFN-γ)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)含量.结果 第28天时博莱霉素组和羧胺三唑组肺系数显著高于空白组,以博莱霉素组高(均P＜0.05).空白组、羧胺三唑组、博莱霉素组肺组织纤维化程度依次加重;空白组、博莱霉素组、羧胺三唑组肺组织羟脯氨酸含量依次为(0.406±0.020)、(0.722±0.118)、(0.537±0.071) μg/mg(均P＜0.05);3组肺组织匀浆中TGF-β1含量依次为(15±5)、(60±10)、(41±10) ng/ml(均P＜0.05),IFN-γ含量依次为(47±5)、(126±24)、(194±34) pg/ml(均P＜0.05),TIMP-1含量依次为(73±6)、(369 ±58)、(246±51) ng/ml(均P＜0.05);而MMP-9含量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 羧胺三唑可减轻博莱霉素致小鼠肺纤维化,其机制可能与TGF-β1、IFN-γ、MMP-9和TIMP-1等细胞因子有关.
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羧胺三唑对角叉菜胶诱导急性炎症的抗炎作用
目的:探讨羧胺三唑(CAI)对角叉菜胶诱导的大鼠足爪急性炎症的预防作用及部分机制.方法:采用角叉菜胶诱导大鼠足爪急性炎症模型,测量足爪肿胀度以及足爪组织中髓过氧化物酶(MPO)、NO、前列腺素2(PGE2)、TNF-α、IL-1β、中性粒细胞趋化因子-1(CNCI-1)和诱导一氧化氮合酶(iNOS).结果:CAI能明显减轻大鼠足爪炎性肿胀,显著降低炎症足爪中MPO、NO、PGE2、TNF-α、IL-1β和CNCI-1含量及iNOS蛋白表达.结论:CAI可能通过减少炎症介质和中性粒细胞浸润来发挥对角叉菜胶诱导急性炎症的抗炎作用.
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RP-HPLC法测定羧胺三唑含量及有关物质
目的:采用反相高效液相色谱法测定羧胺三唑的含量及其有关物质.方法:采用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-水相(45∶55)为流动相;流速2.0 mL·min-1;检测波长:262 nm;柱温:室温;进样量:μL.结果:反相高效液相色谱法测定的线性范围为12.5～200 μg·mL-1;相关系数r=0.9999;日内精密度:RSD为0.38%(n=5);日间精密度:RSD为0.39%(n=5).结论:本法简便快速、准确、专属性好.
