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高效液相色谱/质谱联用测定保健食品中的伐地那非
为测定保健食品中伐地那非,建立了高效液相色谱质谱联用(HPLC-ES/MS)的测定方法.该方法以紫外定量,质谱定性.色谱条件为RP-C18色谱柱,流动相:0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35(体积分数);流速1 ml/min;进样量5μl;检测波长254 nm.质谱采用电喷雾正离子模式(ESI+),扫描范围为:200～700(m/z).伐地那非在3.6～450μg/ml范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系,定量检出限为18 ng,低检出限为0.9 ng(S/N=6).本方法流动相简单,分析时间短且试样预处理简单,灵敏度高,借助质谱的定性能力,可大大提高方法可靠性和抗干扰能力,能准确快速地测定保健食品中的伐地那非.
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羧胺三唑抑制肺癌Lewis细胞生长的机制及抑瘤作用优化探索
目的 研究羧胺三唑(CAI)对小鼠肺癌Lewis细胞(LLC)中环腺苷酸(cAMP)相关磷酸二酯酶(PDE)活性的影响;研究腺苷酸环化酶激动剂Forskolin是否能增强CAI的抑瘤作用.方法 通过改良的Thompson和Appleman两步同位素法对LLC细胞中cAMP相关PDE的活性进行检测,以 PDE4 特异性抑制剂洛利普兰(Rol)作为 CAI 的阳性对照;通过台盼蓝斥染实验对LLC活细胞进行计数,检测Forskolin对CAI抑瘤作用的影响,以双丁酰环腺苷酸(db-cAMP)验证LLC细胞对cAMP含量增加的敏感性.结果 CAI可剂量依赖性地抑制LLC细胞中cAMP相关PDE的活性,CAI与Rol的IC50分别为5.62×10-6 mol/L和1.88×10-8 mol/L.Forskolin和db-cAMP均可剂量依赖性地抑制LLC细胞的活性.CAI与Forskolin合用的抑瘤作用显著优于CAI单用,CAI 5 μmol/L单用时的抑制率为(32.9±10.3)%,与Forskolin 10 μmol/L合用后抑制率可达(67.4±3.76)%(P<0.05).结论 抑制cAMP相关PDE的活性可能是CAI抑制LLC细胞活力的机制之一.通过与升高cAMP的药物如Forskolin合用,可进一步优化CAI的抗肿瘤作用.
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银杏叶提取物单体成分对血小板磷酸二酯酶3活性的作用研究
目的：体外观察银杏叶提取物各主要单体成分对血小板聚集及血小板磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）3活性的影响，明确银杏叶提取物抑制血小板PDE3的确切成分。方法收集分离2周内未服任何药物的健康志愿者的血小板，观察各种浓度的银杏黄酮单体成分槲皮素、山柰酚、异鼠李素和银杏内酯单体成分银杏内酯 A、B、C、J 对血小板聚集抑制率及血小板 PDE3亚型活性的影响，设不加药物、加同等体积药物溶剂为空白对照。结果1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L的槲皮素对ADP诱导的血小板聚集抑制率分别为（47.30±13.80）%、（49.00±11.00）%、（45.90±9.88）%，对 PAF 诱导的血小板聚集抑制率分别为（45.00±15.41）%、（52.10±14.24）%、（50.00±14.38）%，与溶剂对照组相比，差异有统计学意义。同样浓度的山柰酚、异鼠李素、银杏内酯A、B、C、J对ADP、PAF诱导的血小板聚集也均有抑制作用。1、10、100μmol/L的槲皮素作用后血小板PDE3活性分别为（1163.02±523.52） pmol·（mg protein）-1·min-1、（930.98±324.09）pmol·（mg protein）-1·min-1、（820.70±283.14）pmol·（mg protein）-1·min-1，与溶剂对照组相比，差异有统计学意义，同样浓度的山柰酚、异鼠李素、银杏内酯A、B、C、J组的PDE3活性与对照组相比，差异无统计学意义。在槲皮素、山柰酚、异鼠李素、银杏内酯A、B、C、J各药物组内分别对两种诱聚剂ADP、PAF诱导的血小板聚集抑制率进行比较，差别均无统计学意义。对槲皮素作用后的血小板聚集抑制率及PDE3活性进行相关性分析，显示ADP、PAF诱导的血小板聚集抑制率与PDE3活性均无相关性（r＝0.263，r＝-0.013，P均>0.05）。结论银杏叶提取物中各单体成分均有抑制血小板聚集作用。槲皮素具抑制血小板PDE3活性作用，其他单体对血小板PDE3活性无影响。
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ENPP1基因纯合变异导致低磷血症性佝偻病一例并文献复习
目的 探讨ENPP1基因变异致低磷血症性佝偻病患儿的临床特征和基因变异.方法 总结1例2016年8月在首都儿科研究所内分泌科确诊的因ENPP1变异导致的低磷血症性佝偻病患儿临床表现、影像学改变、骨代谢指标及基因等临床资料,并以ENPP1和"低磷血症性佝偻病"及"hypophosphatemic rickets"为关键词,对中国期刊全文数据库、万方数据知识服务平台及美国国家生物技术中心、PubMed 1980年至2017年2月收录的论文进行检索.总结ENPP1基因变异患儿临床表现及基因学特点.结果 患儿女,11岁,因"发现双下肢畸形7年"入院.双膝关节外翻,双下肢X形.血磷0.86 mmol/L,钙2.30 mmol/L,碱性磷酸酶688 U/L.钙磷乘积:25.9.基因检测发现该受检者ENPP1基因在7号外显子发生c.783C>G(p.Tyr 261X)纯合无义变异.受检者父母均携带ENPP1基因c.783C>G(p.Tyr 261X)杂合变异.检索到中文文献1篇(3例),英文文献21篇(17例),共20例患者.均未检出常见导致低磷血症性佝偻病的PHEX基因变异.发病年龄11月龄~10岁.身材矮小8例,4例失聪,婴幼儿广泛动脉钙化史5例,局部动脉钙化3例,假黄瘤3例,后纵韧带钙化2例.20例共检出ENPP1变异有:9种错义变异,6种剪切变异,4种无义变异.c.783C>G变异见于国内2例患儿.结论 低磷血症性佝偻病可由ENPP1基因变异导致,可表现为婴儿广泛动脉钙化、幼年失聪及后纵韧带钙化,故对于PHEX基因阴性的低磷血症性佝偻病可进ENPP1基因检测,需长期随访.ENPP1变异以错义/剪切变异为常见.国内4例中3例均为c.783C
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磷酸二酯酶4D基因与缺血性脑卒中的遗传易患性研究
目的探讨磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因与缺血性脑卒中的关系.方法应用变性高效液相色谱技术筛查454例缺血性脑卒中患者和334例正常对照的PDE4D基因的单碱基多态性(SNP)45和SNP41,应用反相高效液相色谱技术检测人外周血PDE活性和SHR-SP大鼠、SD大鼠及低氧-窒息动物模型的外周血、大脑组织的PDE活性变化.结果本组人群中不存在文献报道的PDE4D基因的SNP45和SNP41的多态改变.病例组外周血PDE活性为13.8±3.1,显著高于对照组(7.3±2.3);SHR-SP的外周血和大脑组织的PDE活性低于正常对照SD大鼠;窒息组的外周血和大脑组织PDE活性稍高于正常对照组;低氧-窒息组的外周血和大脑组织PDE活性显著低于正常对照组和窒息组.结论 PDE4D基因SNP45和SNP41与缺血性脑卒中无关,PDE参与了低氧应激过程.
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5型磷酸二酯酶抑制剂对大鼠不稳定膀胱的作用及其机制
目的 探讨5型磷酸二酯酶抑制剂对不稳定膀胱的作用及可能途径.方法 成年自发性高血压模型SD雄性大鼠24只,随机数字表法分为每日灌胃组、间断灌胃组和空白组,每组8只,每日灌胃组：每日伐地那非(10mg·kg-1·d-1)灌胃;间断灌胃组：每隔3 d伐地那非(10 mg·kg-1·d-1)灌胃;空白组：每日生理盐水灌胃.另以8只成年雄性SD大鼠为对照组,行每日生理盐水灌胃.2周后4组分别行膀胱尿动力学检查.各取4组大鼠膀胱逼尿肌分为2份,用于观察预收缩后硝普钠、Rho激酶抑制剂Y-27632对大鼠膀胱逼尿肌舒张作用的影响及用酶联免疫法测定组织中环磷酸鸟苷(cGMP)含量.结果 空白组膀胱排尿间隔时间及膀胱容量均小于对照组[(409±36)s比(568±60)s;(284±25) μl 比 (395±42)μl,均P<0.01]、储尿期膀胱收缩次数大于对照组[(2.03±0.49) 次/min比(1.07±0.30)次/min,P<0.01];间断及每日灌胃组上述指标[(486±53)s 和 (564±44)s;(337±37)μl 和(392±30) μl;(1.82±0.32 )次/min和 (0.52±0.23) 次/min]较空白组明显改善(P<0.05);且每日灌胃组作用更为显著(P<0.01).间断及每日灌胃组与空白组比较,膀胱逼尿肌对硝普钠敏感性较强[大舒张率：(50.6±2.1)% 和(67.9±4.1)%比(25.3±5.0)%,P<0.01],对Y-27632的敏感性较弱[(35.8±2.5)% 和(20.2±2.3)%比(71.6±2.8)%,P<0.01],组织cGMP含量较高[(20.6±4.1) fmol/mg和(29.4±4.3) fmol/mg比(12.9±2.1) fmol/mg,P<0.01];且每日灌胃组更为明显(P<0.01).结论 高血压模型大鼠膀胱逼尿肌存在不稳定收缩,5型磷酸二酯酶抑制剂能有效治疗不稳定膀胱,且持续每日干预效果更佳.5型磷酸二酯酶抑制剂改善膀胱逼尿肌不稳定收缩可能与cGMP介导的蛋白激酶G-RhoA/Rho激酶途径有关.
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氯胺酮对体外循环患者磷酸二酯酶活性的影响
目的:探讨体外循环(CPB)期间静脉注射小剂量氯胺酮对外周血白细胞磷酸二酯酶(PDE)活性的影响.方法:30例择期行瓣膜置换术患者随机分为氯胺酮组和对照组,每组各15例,于麻醉诱导前、CPB开始后30min及CPB结束后1 h测定血白细胞的PDE活性.结果:两组PDE活性在CPB开始后30min及CPB结束后1h时较术前均显著升高(P＜0.05);但两组间比较,氯胺酮组明显低于对照组(P＜0.05).结论:CPB后人外周血白细胞PDE活性明显升高,小剂量氯胺酮具有抑制其升高的作用.
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类风湿关节炎外周血单个核细胞磷酸二酯酶活性的变化及与间质性肺疾病的关系
目的 观察类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)磷酸二酯酶(PDEs)活性的变化及与间质性肺疾病(ILD)的关系,探讨PDEs在RA及RA-ILD发病机制中的作用.方法 67例初治活动期RA患者分为RA-ILD组30例和单纯RA组37例,同时设健康对照组20名,高效液相色谱法测定PBMCs中环磷酸腺苷(cAMP) PDEs的活性变化,并与患者的临床、实验室及肺损伤指标进行相关性分析.采用单因素方差分析、Student-Newman-Keuls检验、t检验、Spearman相关分析进行统计学分析.结果 ①RA患者PBMC-cAMP-PDEs活性(51±11)高于对照组(34±8,P＜0.01),其中RA-ILD组PBMC-cAMP-PDEs活性(58±10)高于单纯RA组(46±7,P＜0.0l).②RA患者PBMC-cAMP-PDEs水平与晨僵时间、关节压痛数、关节肿胀数、X线分期、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)以及28个关节疾病活动指数(DAS28)评分呈正相关(r值分别为0.432、0.441、0.527、0.430、0.466、0.616、0.662、0.519,P均＜0.01).③RA-ILD患者PBMC-cAMP-PDEs水平与ERS、CRP、RF、CT评分呈正相关(r值分别为0.466、0.616、0.662、0.488,P均＜0.01),与动脉血氧分压(PaO2)呈负相关(r=--0.563,P＜0.01),与肺活量(VC)及一氧化碳弥散吸收率(DLCO)无明显相关性(r值分别为0.118、-0.259,P＞0.05).结论 RA及RA-ILD患者免疫细胞内PDEs活性增高,并与RA疾病活动性及RA-ILD肺损伤严重程度有关,提示PDEs可能参与了RA及RA-ILD的发病过程.
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雄激素对兔阴茎海绵体eNOS和PDE5蛋白表达的影响
目的 研究雄激素对eNOS和PDE5蛋白在同一动物模型中表达的影响.方法 用化学发光法测定新西兰白兔睾酮基线水平和去势后各个时间点的睾酮水平;用Western blot和免疫组化方法分析各组兔阴茎海绵体eNOS和PDE5蛋白的表达.结果 假手术对照组(C组)兔血清睾酮水平和基线值没有显著性差异:去势组(Ox组)睾酮水平在2、4、8周时下降为基线值的17%、14%和1 3%;睾酮补充治疗组(OxT组)睾酮水平在不同剂量睾酮补充之后有所回升.C组eNOS和PDE5蛋白的表达不随时间的推移而变化;Ox组中,eNOS的表达速度、程度和时间推移的关系不明显,但是,PDE5蛋白的表达水平随去势时间的延长而降低;OxT组中eNOS蛋白表达水平没有明显差异,PDE5蛋白的表达水平在补充睾酮前后差异明显.结论 在去势兔模型中,eNOS和PDE5蛋白表达不均衡,致使cGMP的生成和降解不能保持动态平衡,提示运用雄激素维持cGMP的动态平衡是ED治疗机理上的新视角.
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磷酸二酯酶4D基因多态性与缺血性脑卒中的相关性
目的 探讨中国汉族人群磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因多态性与缺血性脑卒中(IS)的相关性.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测440例IS病人和486例健康对照者PDE4D基因单核苷酸多态性(SNP)83和SNP87位点的突变情况,用Logistic回归分析去除混杂因素的影响,比较两组间基因型分布及等位基因频率的差异.结果 两组SNP83基因型分布差异有显著性(x2=8.293,P＜0.05),IS组C等位基因频率明显高于对照组(x2=8.386,P＜0.05).两组SNP87基因型分布差异无显著性(x2=4.716,P＞0.05),IS组T等位基因频率与对照组比较差异无显著性(x2=2.300,P＞0.05).结论 中国汉族人群中,PDE4D基因SNP83可能与IS的发病有关,C等位基因可能是IS的危险因素.
