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A20在大鼠小体积肝移植早期缺血再灌注损伤中的作用机制
目的初步研究A20在小移植物损伤中的地位和作用,为临床应用提供理论依据.方法选取雄性SD大鼠,分为正常对照组、全肝移植组和小体积肝移植组3组,在移植后0.5及3、6、24 h的4个时间点分别取材、送检.主要进行肝功能检测及肝组织病理组织学检查;采用原位末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测A20在肝组织中的表达,Western blot检测肝组织内蛋白的表达.结果移植后各时点丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平均升高,至术后6 h达到高峰,组织病理学检查可见小体积肝移植组移植后6 h损伤重.TUNEL法细胞凋亡检查见小体积肝移植组各时间点细胞凋亡数均显著多于全肝移植组,移植后6 h为高峰.Western blot和RT-PCR法在不同水平检测结果提示保护性基因A20在小体积肝移植组的移植物内表达下降,并随再灌注时间的延长迅速下调.结论大鼠小体积肝移植术后再灌注损伤以肝细胞功能改变及大量肝细胞凋亡为特点.肝组织内保护性基因A20的下调可能是小移植物缺血再灌注损伤发生的重要始动环节之一.
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锌指蛋白A20对抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞LOX-1、TLR-4表达的作用
目的 探讨锌指蛋白A20对氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)和toll样受体-4(TLR-4)表达的作用.方法 体外培养SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),简单随机化分成4组:A组(对照组);B组(OX-LDL组);C组(A20组);D组(ox-LDL+A20组).收集以上各组细胞,用RT-PCR检测LOX-1mRNA和TLR-4 mRNA的表达;提取核蛋白,并用western blot的方法检测NF-κ B核易位的量.结果 ox-LDL刺激大鼠主动脉平滑肌细胞后LOX-1mRNA和TLR-4 mRNA的表达明显增加及核因子κ B(NF-κ B)的活化均明显增加.转染含A20基因质粒的平滑肌细胞TLR-4 mRNA的表达达到正常水平,LOX-1 mRNA的表达及NF-κ B的核移位的量甚至降低到正常水平以下.结论 ox-LDL诱导的平滑肌细胞LOX-1mRNA和TLR-4 mRNA表达增加,可能由此激活TLR-4/NF-κB信号系统,启动动脉壁的炎症反应,触发动脉粥样硬化发生.A20明显抑制了ox-LDL对平滑肌细胞的上述诱导作用,可能由此阻断了ox-LDL引发的不断级联扩大的正反馈效应.阻止了动脉粥样硬化的发展.
关键词： A20 氧化性低密度脂蛋白 氧化低密度脂蛋白受体 Toll样受体-4 核因子κB -
TNFAIP3siRNA对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞NF-κB活性及增殖的影响
目的 探讨A20(TNFAIP3)基因对弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞生长的影响及其与细胞内核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化的关系.方法 采用RNA干扰技术沉默A20,设计3条针对人A20mRNA的siRNA序列,经过lipofectamine RNAiMAX转染至OCI-LY1细胞(DLBCL细胞),用RT-PCR技术检测转染后OCI-LY1细胞内A20 mRNA的表达,用Western blot法检测A20和NF-κB(p65)蛋白的表达.用MTT法检测A20基因沉默后OCI-LY1细胞体外生长活力变化.结果 (1) siRNA转染组A20 mRNA及编码蛋白表达较未转染组及阴性对照组明显降低(P＜0.05);(2)转染组p65蛋白的表达较未转染组和阴性对照组明显增高(P＜0.05);(3)转染组细胞较未转染组、阴性对照组的OCI-LY1细胞体外生长活力明显增强.三组siRNA序列中siRNA-2序列干扰效果明显.结论 DLBCL细胞中A20基因沉默会导致NF-κB活性增强,从而增强淋巴瘤细胞的生长活力.
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DCLK1和A20在非小细胞肺癌中的表达及意义
目的 探讨肿瘤相关因子双肾上腺样激酶1(DCLK1)和肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(A20)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达情况及临床意义.方法 用免疫组织化学方法检测DCLK1和A20在61例肺癌和22例癌旁肺组织中的表达.结果 (1)非小细胞肺癌原发灶组织和癌旁肺组织中A20的表达阳性率分别为59.0％(36/61)和18.2％(4/22),两组之间差异有统计学意义(P<0.05);非小细胞肺癌原发灶组织和癌旁肺组织中DCLK1表达阳性率分别为21.3％(13/61)和27.3％(6/22),两组间差异无统计学意义(P>0.05);(2)A20蛋白阳性水平与淋巴结转移显著相关(P<0.05),与NSCLC病理组织类型、肿瘤组织分化程度无相关性(P>0.05).DCLK1蛋白阳性水平与肿瘤组织分化程度、临床分期及淋巴结转移均无相关性(P>0.05).结论 A20在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其表达情况与淋巴结转移相关,可能参与了非小细胞肺癌的发生和发展,DCLK1与非小细胞肺癌的进展无明显关系.
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IL-17对小鼠脊髓星形胶质细胞相关炎性因子及A20、NF-κB蛋白表达的影响
[目的]探讨白介素17(Interleukin-17,IL-17)对小鼠脊髓星形胶质细胞相关炎性因子产生及A20(tumor necrosis factor α inducible protein 3,TNFAIP3)、NF-κB蛋白表达的影响.[方法]使用不同浓度的IL-17刺激体外培养小鼠脊髓星形胶质细胞,并于不同时间点(3、6、12、24和48h)行酶联免疫吸附检测(ELISA)法和qRT-PCR检测IL-6、TNF-α、MIP-2、MCP-1/5的表达,采用蛋白质免疫印迹法(WB)和qRT-PCR检测A20、NF-kB的表达.[结果]与对照组相比,实验组小鼠脊髓星形胶质细胞在IL-17刺激6、12 h时,IL-6、TNF-α、MCP-1/5和MIP-2 mRNA和蛋白的表达水平分别显著升高(P＜0.05);NF-κB mRNA和蛋白的表达分别在6h和12h时显著升高,A20蛋白在12 h时表达量显著减少与NF-κB呈相反趋势,但其mRNA的表达呈逐渐减少趋势.[结论]A20和NF-κB可能在小鼠脊髓星形胶质细胞相关炎性因子产生过程中起调节作用.
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甲状腺素对胰岛β细胞A20 mRNA表达作用的研究
目的 研究甲状腺素对胰岛β细胞A20 mRNA表达作用的影响,观察大鼠胰岛β细胞形态学变化.方法 采用氧化酶法及放射免疫法测定大鼠血清葡萄糖和血清胰岛素的含量.大鼠胰岛β细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳,检测凋亡条带的形成.RT-PCR检测胰岛细胞抗凋亡蛋白A20(TNF-induced protein 3)mRNA的表达.结果 给予T4(600μg·kg-1·d-1)灌胃14d后,可使大鼠血清胰岛素水平明显降低(P＜0.05),血糖水平则明显升高(P＜0.01),并且大鼠胰岛β细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型凋亡梯状条带.而给予T4灌胃7d时,不发生上述改变.A20 mRNA在给予T4(600μg·kg-1·d-1)灌胃7d和14d组有表达,而且后者明显低于前者(P＜0.01),但在对照组和给予T4灌胃21d组无表达.结论 T4引起胰岛细胞的凋亡可能与抗凋亡蛋白A20在胰岛β细胞的非持续性表达有关.
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A20和Caspase 3在异基因CD8+ T细胞致人脐静脉内皮细胞凋亡中的表达及意义
目的 探讨异基因造血干细胞移植时,供体CD8+T细胞致受体人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡中A20蛋白及Caspase 3的表达及意义.方法 采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,CD8+ T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD8+T细胞.HUVEC细胞株经过5 ng/ml TNF-α处理后与CD8+T细胞进行混合培养.以AnnexinⅤ和PI双标后,流式细胞仪对HUVEC进行凋亡分析,用全波长荧光分光光度计测定凋亡相关蛋白Caspase 3的活性.Western blot法检测HUVEC中A20蛋白的表达.结果 异基因CD8+T细胞在与HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡,流式细胞仪检测显示24 h时的早期凋亡率高,达(83.6±0.42)%.而晚期凋亡相关蛋白Caspase 3活性在48 h时达高峰,荧光强度为(13.585±0.269), 此后显著降低,与对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01).A20蛋白的表达与HUVEC的凋亡率呈负相关(r=-0.839, P<0.05).结论 体外供体CD8+T细胞致受体HUVEC凋亡过程中,信号蛋白Caspase 3的激活介导了凋亡的发生,而A20可能对其起负调节作用.
关键词： 异基因CD8+T细胞 人脐静脉内皮细胞 细胞凋亡 Caspase 3 A20 -
Tet-on系统调控A20基因在鼻咽癌肝转移亚系中的表达
目的 构建pSUPERIOR-A20可调控性载体,检测其在肝转移亚系中表达的可调控性.方法 通过基因芯片筛选出鼻咽癌肝转移相关基因,结合文献调研获得头颈部癌转移标签基因,并通过荧光定量PCR检测发现A20可能在鼻咽癌肝转移过程中发挥了重要作用.在线设计A20特异性干扰片段,选择相应酶切位点后将其插入pSUPERIOR质粒中,应用酶切鉴定和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将pSUPERIOR质粒和Tet-on质粒共转染肝转移亚系5-8F-H3,PCR检测A20的表达.结果 Real-time PCR检测A20在肝转移亚系5-8F-H3中的表达显著上调,结果具有统计学意义(P=0.005).且成功构建了pSUPERIOR-A20载体,与Tet-on质粒共转染5-8F-H3后经嘌呤霉素筛选克隆,经荧光定量PCR检测阳性克隆A20基因的表达显著下调.结论 成功构建pSUPERIOR-A20载体,并可有效干扰鼻咽癌肝转移亚系5-8F-H3中A20基因的表达,为进一步研究A20在鼻咽癌肝转移中的作用奠定了良好的基础.
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从炎症调节因子到肿瘤抑制因子——A20的特点及其在淋巴细胞肿瘤发生中的作用
A20是炎症信号传导的中心调节因子-NF-κB抑制因子,而近年研究发现A20更重要的功能是作为一个肿瘤抑制因子,其缺失在淋巴细胞肿瘤的发生中有重要的作用.综述近年所报道的A20生物学功能、分子机制及其在淋巴细胞肿瘤中调节作用的研究进展.
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MALT1-A20-NF-κB 信号分子在MM中的表达特点
目的：了解多发性骨髓瘤（MM）患者外周血中黏膜相关组织淋巴瘤异位基因1（MALT1）、A20与核转录因子κB（NF-κB）基因的表达特点。方法：采用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR和相对定量分析法检测20例MM患者（Ⅰ期7例，Ⅱ期3例，Ⅲ期10例）及21例健康人外周血单个核细胞（PBMC）中MALT1、A20和NF-κB基因的表达情况。以β2微球蛋白基因（β2m）作为内参；采用相对定量公式：α-ΔCt ×100％，分别计算MALT1、A20和NF-κB基因的表达水平。结果：MM患者PBMC中的MALT1和A20基因的表达水平较健康人都有明显的降低（P＝0.000），而MM中NF-κB基因的表达水平较正常人有所升高，但无统计学差异（P＞0.05）。在健康人组，MALT1和NF-κB的表达水平呈现正相关（P＝0.001，r＝0.666），而在MM组，MALT1、A20与NF-κB 3种基因均不存在明显相关性。同时，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1基因的表达量较健康人明显降低（P＜0.05），A20基因的表达量较健康人明显降低（P＜0.01），而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期MM患者MALT1、A20和NF-κB之间的表达情况均无统计学差异。结论：当MALT1-A20介导的细胞免疫和炎症的信号通路发生异常改变时，可能与MM的发生发展有着密切关系。
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单核细胞Toll样受体4信号通路在不稳定型心绞痛炎症反应中的作用探讨
目的:探讨单核细胞Toll样受体4(TLR4)信号通路在不稳定型心绞痛炎症反应中的作用.方法:以TLR4配体LPS刺激不稳定型心绞痛患者及对照者单核细胞,应用实时定量RT-PCR检测单核细胞TLR4 mRNA、A20 mRNA的变化,ELISA法检测培养上清TNF-α、IL-10 浓度.结果:不稳定型心绞痛患者单核细胞TLR4 mRNA、A20 mRNA相对表达量高于对照组.受LPS刺激后A20 mRNA 无明显上调.不稳定型心绞痛患者单核细胞LPS刺激后与对照组单核细胞LPS刺激后相比,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生更多,白介素-10(IL-10)产生较少.结论:单核细胞TLR4信号通路参与不稳定型心绞痛的炎症反应.TLR4表达上调、A20上调不足与炎症反应有关.
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锌指蛋白A20调节炎症信号的作用与机制研究进展
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子的防御性反应,炎症信号起始于模式识别受体(PRR)与病原生物表面的病原体相关分子(PAMP)相互识别和作用,继而启动免疫应答,在机体抵抗外来感染的过程中发挥着关键作用[1].
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A20人工锌指转录因子真核载体的构建及其对内皮细胞炎症反应的影响
目的 观察A20基因的人工锌指转录因子(zinc finger-artificial transcription factor,ZF-ATF)对内源性A20基因及内皮细胞炎症反应的影响.方法 根据人A20基因的序列,设计出其ZF-ATF,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,与通过BamH Ⅰ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体,质粒转化感受态细菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定,鉴定阳性克隆进行测序.质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),通过Western blot检测A20蛋白的表达,用脂多糖(LPS)诱导HUVEC细胞产生炎症反应,利用Western blot检测NF-κB p65的表达情况,利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等的水平.结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成的含ATF的真核载体寡核苷酸链插入正确,Western blot证实转染HUVEC后A20蛋白表达显著增加.ELISA法检测结果表明,在LPS刺激后,空载体组及空白组细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α表达均明显上调,而ZF-ATF转染组没有明显上调,与空载体组及空白组比较,有统计学差异(P＜0.05,P＜0.01)；Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达(19.8±4.5)较空载体组(90.2±5.9)及空白组(96.3±3.3)显著下调(P＜0.01).结论 成功构建人工锌指转录因子真核表达载体,且能够启动内源性A20的稳定表达,并发挥其抗炎等作用.
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基于流体动力学的mA20质粒及其突变体转染对实验性小鼠内毒素血症的治疗作用
目的 研究mA20及其突变体mA20-ZnF4-7质粒对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)攻击所致实验性内毒素血症小鼠的治疗作用.方法 用LPS攻击小白鼠制备内毒血症动物模型.按10 μg质粒/1.6 ml生理盐水比例溶于生理盐水中,采用基于流体动力学基因转染方法对实验组小鼠进行质粒注射.以ELISA检测各组血浆和组织TNF-α、IL-1β表达.12 h观察组织病理变化.结果 ①mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的TNF-α在各时间点的表达分别为:6 h:(201.797±4.789)、(235.710±6.108) pg/ml,12 h:(236.580±7.497)、(255.130±7.827) pg/ml,24 h:(154.551±16.460)、(223.246±11.316) pg/ml;两组间无显著性差异(P＞0.05);与单纯内毒素组、空质粒组的TNF-α表达比较有显著性降低(P＜0.05).②mA20质粒治疗组、mA20-ZnF4-7质粒治疗组的IL-1β在各时间点的表达分别为:6 h:(87.103±3.840)、(101.586±2.486) pg/ml,12 h:(83.655±4.973)、(94.460±3.110) pg/ml,24 h:(77.678±6.555),(87.103±4.826) pg/ml;该两组间无显著性差异(P＞0.05);与单纯内毒素组、空质粒组的IL-1β表达比较有显著性降低(P＜0.05);各时间点之间比较无明显差别(P＞0.05).③病理学观察结果显示:mA20治疗组、mA20-ZnF4-7治疗组的肝、肺损伤均较单纯内毒素组、空质粒组轻;与生理盐水对照组相比,肝、肺损伤无明显差别(P＞0.05).结论 "基于血流动力学的基因转染方法"能有效地把目的质粒DNA转入肝、肺;对实验性类毒素血症小鼠体外转染mA20-ZnF4-7和mA20有相似的治疗作用,这为临床应用提供一定的实验基础.
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牛磺酸抗细胞因子诱导的原代培养胰岛细胞凋亡与抗凋亡蛋白A20的变化
目的探讨白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)和γ-干扰素(IFN-γ)引起的原代培养胰岛细胞凋亡与A20蛋白表达变化以及牛磺酸对其影响.方法用体外单层培养的方法,培养Wistar大鼠胰岛细胞,采用流式细胞仪、DNA电泳、放射免疫法及其RT-PCR等分别观察IL-1β、TNF和 IFN-γ对胰岛细胞凋亡细胞百分率、DNA片段、培养液中胰岛素分泌以及A20蛋白表达的影响,并进一步观察牛磺酸的作用.结果流式细胞仪分析显示IL-1β、TNF和 IFN-γ联合可诱导胰岛细胞凋亡率增加(从3.5%增加到30.2%),DNA明显片段化,同时胰岛素分泌明显降低(P<0.01), 而A20蛋白无表达;牛磺酸能阻断上述细胞因子的作用(P<0.01).结论牛磺酸能够改善细胞因子诱导的原代培养胰岛细胞凋亡,其机制可能与促进A20蛋白表达有关.
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重组人A20蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达
目的利用酵母表达技术制备重组人A20蛋白(rhA20),为进一步研究其在脓毒血症中的治疗作用奠定基础.方法利用基因工程技术构建rhA20毕赤酵母表达载体yevCFP-hA20,电转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,筛选高拷贝阳性菌株,甲醇诱导表达rhA20.产物用SDS-PAGE和Western Blot鉴定.同时对诱导表达培养基的pH值和配方,以及培养环境温度等条件进行了优化研究.结果表达产物分子量约93×103,表达条件的优化研究提示:降低诱导培养基pH值、添加低剂量EDTA、蛋白酶水解物和降低培养温度,可以使全长表达产物提高¨倍,占总蛋白的18.24%,达到(254.10±24.52)μg/ml水平.结论我们成功在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了rhA20,通过对诱导培养基成分及诱导温度的优化,使全长rhA20表达得到明显提高,探索了人A20的生物合成途径,也为巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白遭遇降解时的处理提供了新的方法.
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人A20基因ORF的克隆
目的克隆人A20 ORF,为人A20的体外合成、抗体制备奠定基础.方法从LPS诱导的人外周血白细胞炎症模型中提取总RNA,用特异性引物介导的逆转录反应合成cDNA第一链,经巢式梯度RT-PCR的两次扩增,终得到2 36l bp长的人A20 ORF并插入pCRR4-TOPOR载体测序验证.结果采用巢式梯度RT-PCR我们成功收获了人A20 ORF,测序结果与GenBank公布结果完全一致.结论采用巢式梯度RT-PCR克隆人A20 ORF,在技术路线上可以为某些难克隆基因提供参考.
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LPS引起的炎症状态下免疫分子A20降低人脐静脉内皮细胞损伤及机制研究
目的 探讨在LPS引起的炎症状态下A20对人脐静脉内皮细胞凋亡、成管的影响及可能机制.方法 获取人脐带静脉内皮细胞,转染A20慢病毒后LPS刺激下利用CCK-8及流式细胞术检测内皮细胞凋亡情况,显微镜下观测成管实验;Western blotting检测 NF-κB通路活化情况;ELISA法检测培养上清中可溶性E-selectin的分泌情况.结果 1)与正常对照相比,A20抑制炎症刺激下人脐静脉内皮细胞的凋亡率(P＜0.001);2)与正常对照相比,A20促进炎症刺激下人脐静脉内皮细胞成管率(P＜0.001);3)在炎症状态下A20通过抑制NF-κB通路对人脐静脉内皮细胞起保护作用.结论 LPS引起的炎症状态下,A20可通过抑制NF-κB通路使E-selectin表达降低,从而保护炎症状态下的人脐静脉内皮细胞活性及功能,提示A20可作为干预心脑血管患者血管内皮细胞的一个重要靶点.
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伊马替尼抑制Jurkat T细胞增殖与影响A20和NF-κB表达相关
目的 研究伊马替尼(IM)对T细胞Fyn、A20和NF-κB转录的影响及意义.方法 50 nmol/L浓度IM作用Jurkat细胞24 h后,以K562细胞为对照,应用实时荧光定量PCR技术检测Fyn、A20和NF-κB基因表达水平变化；Western blot技术检测A20和NF-κB蛋白水平变化.结果 IM明显上调Jurkat细胞A20基因表达水平,明显下调NF-κB基因表达水平,而Fyn基因表达水平没有明显变化.K562细胞受到IM处理后,A20和NF-κB的表达水平改变与Jurkat细胞相似,但Fyn基因水平明显下调.Fyn基因表达下调与IM下调BCR/ABL融合基因表达有显著的相关性.A20和NF-κB蛋白水平变化与mRNA变化一致.结论 IM不仅通过抑制BCR/ABL融合基因表达下调Fyn转录水平,而且也可通过上调A20和下调NF-κB表达抑制T细胞增殖作用.
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不同疾病状态下类风湿关节炎患者外周血和关节液A20基因表达水平的改变特点
目的 分析A20和NF-κB基因在类风湿关节炎(RA)患者外周血和关节液中的表达水平及治疗前后表达水平的变化,探讨A20在RA炎症发生发展的作用.方法 利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测RA患者外周血和关节液中单个核细胞A20和NF-κB基因表达水平以及RA患者治疗前(疾病活动期)和治疗后3个月外周血单个核细胞(PBMCs)A20和NF-κB基因表达水平.结果 1)疾病活动期54例RA患者PBMCs中A20表达水平(6.52±5.85)明显低于健康对照组(34.47±26.55,P＜0.001),NF-κB表达水平(1.55±2.02)高于健康对照组(0.59±0.16,P=0.046);2)14例RA患者PBMCs中A20 (8.07±6.25)和NF-κB(7.11±19.01)与关节液单个核细胞A20 (7.74±5.74)和NF-κB (0.76±0.24)表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);3)19例RA患者治疗后3月病情明显缓解,治疗后PBMCs中A20表达水平(10.18±13.22)较治疗前(2.32±1.87)明显升高(P=0.019),但治疗后外周血A20表达水平仍然明显低于健康对照组(P＜0.001);NF-κB表达水平在治疗前后无明显变化(P=0.403).结论 RA患者外周血A20表达水平明显降低,并与NF-κB表达水平上调相对应,而RA疾病缓解后,A20表达水平有所恢复.RA患者关节液中A20和NF-κB表达水平与患者外周血中A20和NF-κB相似.
