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组织工程化血管移植实验研究
目的 通过体外构建、体内培养的方法 构建组织工程化血管,并将其植入动物的股动脉,探讨利用小口径组织工程化血管进行血管移植的可能性.方法 首先用Brdu标记所有种子细胞,将血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分层种植于胶原包埋PGA的复合支架表面;然后将细胞和支架的复合体种植于动物皮下构建组织工程化血管,并移植到股动脉;后行HE染色及免疫荧光等相关检查,了解移植后血管的特点及细胞来源.同时以移植物为单纯支架在皮下培养所形成的管状结构作为对照组.结果 移植后组织工程化血管通畅无血栓形成.HE染色见血管壁和正常生理性血管壁的结构相似.可分内膜、中膜和外膜三层.种植2周后Brdu标记细胞的免疫荧光观察证实血管壁细胞来源于所种植的种子细胞.结论 利用骨髓间充质干细胞分化而来的种子细胞和胶原包埋的PGA支架可以构建组织工程化小口径血管,而且可以移植入动物体内.
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犬小口径组织工程化血管移植
目的 研究利用小口径组织工程化血管进行血管移植的可能性.方法 来源于骨髓间充质干细胞分化的血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分层种植于胶原包埋的PGA复合支架上;将复合体种植于动物皮下构建初级组织工程化血管,然后移植组织工程化血管于股动脉,行相关检查,了解移植后血管的特点及细胞来源.结果 组织工程化血管移植物通畅,管腔无瘤样扩张,血管搏动佳,内膜光滑,无血栓形成.HE染色见血管壁和正常生理性血管壁的结构相似,分内膜、中膜和外膜三层;免疫荧光观察证实血管壁细胞来源于所种植的种子细胞.结论 组织工程血管可以移植于动物体内,该复合体具有与天然血管相似的结构和功能.
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组织工程化血管构建的初步实验研究
目的探讨组织工程化血管构建的初步实验方法.方法预构具有三维结构的胶原蛋白-几丁聚糖骨架,以人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞作为种子细胞,培育后二步法种植并行工程化血管成熟培养.经生物学检测,补片修补实验鼠腹主动脉人为缺损.结果人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞可作为种子细胞应用;预制的三维骨架具有良好的组织和细胞兼容性,种植种子细胞后可形成良好的细胞黏附、生长;体外静态及生物反应器培养,工程组织中细胞数及细胞外基质含量明显增加(P<0.05);血小板凝集试验表明该工程组织具有一定的抗凝特性;修补大鼠腹主动脉缺损,术后10 d可维持通畅.结论胶原蛋白-几丁聚糖预构的三维骨架可应用于血管组织工程研究,细胞种植后经成熟培养,可初步构建具有一定强度和抗凝特性的组织工程化血管.
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组织工程化血管的构建及其功能评价
组织工程化血管的出现为治疗血管缺损提供了新的希望.本文综合国内外新文献,就组织工程化血管的种子细胞来源、细胞外基质生物材料的选择以及用于培养工程化血管的生物发生器的设计等方面进行了综述.同时,讨论了不同培养条件对组织工程化血管发育和功能的影响,并提出了组织工程化血管的功能评价方法.后,指出了目前尚需解决的问题和对未来研究的展望.
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初级组织工程小口径血管的制备
目的 探讨利用组织工程技术构建小口径组织工程化血管的可行性.方法 将犬骨髓细胞诱导为平滑肌细胞和内皮细胞后,用Brdu标记平滑肌细胞,DAPI标记内皮样细胞,观察细胞标记的成功率;血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分层种植于胶原包埋PGA的复合支架表面:将细胞和支架的复合体种植于犬皮下,并设立对照组,分别于植入后的第4、6、8周取出植入皮下的组织工程化血管,进行相关检查分析.结果 免疫荧光提示Brdu、DAPI标记种子细胞效果良好;核呈蓝色荧光的内皮样细胞均匀排列在支架表面:组织工程化血管材料植入动物皮下取出后观察,实验组管壁结构比较清晰,细胞数量也已减少、胶原成分增多,管壁分层明显,可见内膜、中膜和外膜结构,对照组无此特点;免疫荧光观察,8周实验组组织工程血管壁内有Brdu标记的种子细胞存在.结论 以动物的皮下为生物反应器,采用静态培养的方式可强化组织工程血管壁,该组织的结构与天然血管相似,种子细胞同时参与初级组织工程小口径血管的构建.
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内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用
目的:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因,一氧化氮可以抑制上述生物反应,但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否抑制种植了平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实.实验拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响.方法:实验于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成.①实验材料:1月龄新西兰大白兔1只,用来获取平滑肌细胞.成年新西兰大白兔18只,随机数字表法分成3组,每组6只.正常细胞组移植未种植细胞的人工血管;LacZ转染组移植种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管,内皮型一氧化氮合酶转染组移植种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管.②实验方法:构建含有报道基因lacZ和内皮型一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白,并转染平滑肌细胞.将转染了基因的细胞种植在人工血管上,并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉.③实验评估:测定转染内皮型一氧化氮合酶基因及LacZ基因细胞培养上清中一氧化氮含量.血管植入30,100 d 后X-gal染色及苏木精-伊红染色观察人工血管上的平滑肌细胞,同时显微镜下测量每段血管内膜增生的厚度.结果:纳入成年新西兰大白兔18只,均进入结果分析.①内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于未转染的正常细胞组(P ＜ 0.05).平滑肌细胞转染lacZ基因后经X-gal染色,倒置显微镜下可见转染了基因的细胞被染成蓝色.②血管植入30 d,与正常细胞组比较,LacZ转染组和内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度差异无显著性(P ＞ 0.05);100 d后,内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度与正常细胞组无明显差异,与LacZ转染组相比较,差异显著(P ＜ 0.05).结论:内皮型一氧化氮合酶基因转染抑制了种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生.
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骨髓间充质干细胞-聚乙醇酸支架复合体种植动物皮下构建组织工程化小口径血管
背景:课题组的前期工作已证实骨髓间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞,并证实所诱导的细胞和胶原包埋的聚乙醇酸支架具有良好的组织相容性.目的:探讨利用动物皮下作为生物反应器构建小口径组织工程化血管的可行性.方法:骨髓间充质干细胞诱导分化为血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞,分层种植于胶原包埋聚乙醇酸支架表面,然后将细胞-支架复合体种植于动物皮下,构建小口径组织工程化血管.结果与结论:人工血管组织学观察见管壁结构清晰,其大体结构和天然血管相似,可承受26.6 kPa的血管腔内压力不破裂.皮下培养8周免疫荧光观察Brdu标记的部分细胞核呈现明亮的黄绿色荧光.结果说明利用动物的皮下作为生物反应器,采用静态培养的方式构建小口径组织工程化血管是可行的.
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内皮型一氧化氮合酶基因转染对移植人工血管内膜增生的作用
背景:平滑肌细胞增殖移行和血小板激活导致血栓形成是移植血管再狭窄的主要原因,一氧化氮可以抑制上述生物反应,但内皮型一氧化氮合酶基因转染是否可以抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生还未得到证实.目的:拟进一步观察内皮型一氧化氮合酶基因转染对种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生的影响.设计、时间及地点:重复观察测量,于2006-04/2007-05在西安交通大学医学院中心实验室及分子生物学实验室完成.材料:1月龄新西兰大白兔1只,用来获取平滑肌细胞.成年新西兰大白兔18只,随机分成3组,正常对照组植入未转染的人工血管,LacZ转染组植入种植转染lacZ的平滑肌细胞的人工血管,内皮型一氧化氮台酶转染组植入种植内皮型一氧化氮合酶的平滑肌细胞的人工血管,6只/组.方法:构建含有报道基因lacZ和内皮犁一氧化氮合酶基因的假型反转录病毒载体小鼠白血病病毒/疱疹性口炎病毒G糖蛋白,并转染平滑肌细胞.将转染了基因的细胞种植在人工血管上,并用血管旁路移植的方法植入兔腹主动脉.主要观察指标:瓜氨酸法检测细胞培养上清中一氧化氮含量.移植血管内膜X-gal染色观察,种植的平滑肌细胞为蓝色,而内源性细胞为红色.显微镜下测量血管内膜增生厚度.结果:18只兔均进入结果分析.内皮型一氧化氮合酶转染组一氧化氮含量明显高于正常对照组(P<0.05).转染lacZ基因的平滑肌细胞经X-gal染色呈蓝色.血管平滑肌细胞植入30 d,各组内膜厚度基本相似(P>0.05):植入100d,正常对照组与内皮型一氧化氮合酶转染组内膜厚度堆本相似(P>0.05),两组明显均低于lacZ转染组(P<0.05).结论:内皮型一氧化氮合酶基因转染可抑制种植平滑肌细胞的人工血管内膜增生.
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动态反应器构建组织工程化血管的初步实验研究
目的 以自行设计的旋转细胞培养器和动态反应器比较静态和动态培养条件下细胞增殖的差异,以期为体外构建组织工程化血管提供依据.方法 将兔骨髓间充质干细胞种植在氧等离子体辐照10 min聚氨酯膜制成的管状支架上进行细胞培养,比较静态和动态种植、静态和动态培养细胞增殖率的差异.结果 自制的旋转培养器、动态反应器工作状态稳定；培养第7,14,28天动态培养组光密度值均高于静态培养组(P＜0.01)；培养28 d甲苯胺蓝染色及扫描电子显微镜观察显示,动态培养组细胞增殖数较静态培养组多、生长更致密,且有顺培养液流动方向排列的趋势.结论 动态细胞的种植与培养优于静态.自制的旋转培养器、动态反应器可用于初步的动态培养实验,但仍有待改进.
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聚氨酯不同低温等离子体改性及生物相容性评价
目的 为构建组织工程化血管提供组织相容性好的支架材料.方法 聚氨酯膜分别用CO2,O2,NH3和SO2 4种低温等离子体辐照进行改性,每种等离子体分别辐照2,5,10,15 min,采用生物学与材料学方法对改性前、后聚氨酯表面的理化特性及组织相容性进行比较.结果 CO2,O2及NH3等离子体改性后与未改性聚氨酸膜外观相同,倒置相差显微镜观察、电子显微镜扫描及甲苯胺蓝染色显示细胞在CO2,O2及NH3等离子体改性聚氨酸膜上生长状况较改性前好,O2辐照10 min的聚氨酸膜上细胞生长状况较其他等离子体及其他辐照时间好(P＜0.05)；改性后材料的表面粗糙度有所增加,并成功引入-OH、-COOH、-NH2、-SO3H等极性基团,这些基团明显改善聚氨酯表面的组织相容性；与改性前及其他方法比较,O2等离子体辐照10 min的聚氨酯组织相容性明显改善.结论 低温等离子体是一种有效改善聚氨酯组织相容性的方法；O2等离子体辐照10 min的改性效果良好.
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组织工程化血管研究进展
组织工程化血管技术为解决心外科血管移植物不足的难题提供了新思路,研究重点集中在种子细胞选择、支架材料改性、血管构建模式优化等方面,本文就组织工程化血管研究进展作一综述.
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动物体外构建初级组织工程化血管、体内强化的实验研究
目的 采用在动物体外构建初级组织工程化血管、体内强化的方法 ,探讨组织工程技术构建组织工程化血管的可能性.方法 5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记所有种子细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记内皮样细胞,观察细胞标记的成功率;血管平滑肌样细胞(VSMLCs)和血管内皮样细胞(VELCs)分层种植于胶原包埋聚乙醇酸(PGA)的复合支架表面;将细胞和支架的复全体种植于动物皮下,并设立对照组,分别于植入后的第4,6、8周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织工程化血管,行组织学及免疫荧光等检查.结果 组织学观察实验组管壁结构比较清晰,细胞数量也已减少,胶原成分增多,管壁分层明显,可见内膜、中膜和外膜,对照组无此特点;实验组皮下培养8周Brdu标记细胞的免疫荧光观察见部分细胞核呈现明亮的黄绿色荧光,证明来源于所种植的种子细胞.结论 体外构建的初级组织工程化血管,以动物的皮下为生物反应器,采用静态培养的方式可使血管壁得以强化,从而构建出次级组织工程化血管;组织工程技术构建的次级工程化血管组织其大体结构与天然血管相似;血管壁细胞有种植的种子细胞生长,并参与了.组织工程化血管的重构.
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组织工程化小口径血管在体移植的研究
我们通过体外构建、体内培养的方法构建组织工程化和血管,然后植入动物的股动脉,探讨利用小口径组织工程化血管进行血管移植的可能性.
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人抗凝血酶Ⅲ基因转染血管内皮样细胞的表达
目的 观察人抗凝血酶Ⅲ(human antithrombin-Ⅲ,hAT-Ⅲ)基因转染血管内皮样细胞(VELCs)后的表达情况. 方法 体外分离、培养和扩增的人骨髓间充质干细胞(BMMSCs),定向诱导分化产生血管内皮样细胞,然后将血管内皮样细胞随机分为实验组和对照组,实验组采用脂质体转染方法,将携带hAT-Ⅲ基因的质粒DNA转染血管内皮样细胞,分别于转染后72h、96h,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western-Blotting)和发色底物法检测细胞hAT-Ⅲ的表达;对照组细胞采用空白TE缓冲液代替质粒DNA,其余方法完全同实验组. 结果 RT-PCR显示实验组细胞扩增出hAT-Ⅲ特异片段,对照组阴性;免疫组化显示实验组细胞阳性表达hAT-Ⅲ,对照组阴性;Western-Blotting显示实验组细胞培养上清液中有hAT-Ⅲ特异条带,对照组阴性; 发色底物法检测显示实验组细胞hAT-Ⅲ活性为9.50%±1.52%,对照组为1.83%±1.17%,两组比较差异有统计学意义(t=7.910,P<0.01). 结论 hAT-Ⅲ基因可以成功转染血管内皮样细胞并进行表达.
