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大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞
①目的 探讨体外分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为血管内皮样细胞及其为组织工程血管的构建提供种子细胞的可能性.②方法 收集大鼠股骨骨髓血,进行体外扩增培养成纯化的间充质干细胞,取第4～6代生长状态良好的间充质干细胞,用含40 ng/mL内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)培养液诱导细胞,利用免疫组织化学观察vWF的表达.③结果 通过离体培养可使体内环境下低浓度的骨髓间充质干细胞实现数目扩增;诱导14天后实验组细胞vWF强阳性表达,接近汇合的细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态,对照组细胞vWF呈阴性表达.④结论 体外可以获得足够量的较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞,而间充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞.
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血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞
背景:骨髓间充质干细胞植入机体不同类犁组织后可以分化为相应组织的靶细胞,提示机体内局部微环境可诱导和决定干细胞的发育取向,但其诱导分化条件和具体作用机制尚不清楚.目的:检测血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导入骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:健康骨髓来源于南昌大学第一附属医院内科同期收治的临床骨髓穿刺检查正常的5例住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Cytolab公司产品.方法:无菌条件下取健康人骨髓,采用Ficoll密度梯度离心+贴壁法分离纯化培养骨髓间充干细胞.取传至第3代细胞,诱导组加入含10μg/L血管内皮细胞生长因子、5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的DMEM培养液,对照组仅加入含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液,置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态学变化,免疫细胞化学染色检测CD34、Ⅷ因子的表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果:诱导组细胞由长梭形变为短梭形和扁平形,呈内皮样细胞形态特征,CD34、Ⅷ因子均呈阳性表达,细胞胞浆内可见W-P小体.对照组细胞CD34、Ⅷ因子呈阴性.结论:血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子可成功诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞.
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大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究
目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),并行多向分化潜能的鉴定.方法 经Percoll 梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞.贴壁培养后, 通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析.传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定.结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀, 基本上呈梭形或星形的上皮样细胞, 传代培养后的细胞体积增大, 成纤维样细胞逐渐增多.经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞.结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞.
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骨髓间充质干细胞诱导分化为组织工程血管用种子细胞的研究
目的 探讨利用犬骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为血管内皮样细胞及平滑肌样细胞的实验方法.方法 无菌条件下获得犬骨髓后采用密度梯度离心和贴壁培养的方法分离、纯化及培养犬骨髓间充质干细胞,使用流式细胞术鉴定其表面标志物.分别使用合适的培养基加入适当的诱导因子对纯化和扩增后的骨髓间充质干细胞进行诱导,使其在体外分化成血管内皮样细胞及平滑肌样细胞,然后进行鉴定.结果 第3代骨髓间充质干细胞表面CD34表达阴性细胞数为99.98％;CD44表达阳性率为99.36％.利用第2代或第3代骨髓间充质干细胞,向血管内皮样细胞及平滑肌样细胞诱导分化,内皮样细胞呈“铺路石”样改变,血管性假性血友病因子(vWF)及CD31免疫荧光染色呈阳性;平滑肌样细胞具有“波峰-波谷”形状,α-肌动蛋白(α-actin)、钙调理蛋白(calponin)及平滑肌重链(SMMHC)免疫荧光染色为阳性.结论 利用犬骨髓间充质干细胞,使用适当的细胞因子进行诱导,在体外可以成功地将其分化为血管内皮样细胞及平滑肌样细胞.
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犬骨髓基质干细胞源性血管内皮样细胞的诱导分化及细胞特征鉴定
目的 采用血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导犬骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),探讨BMSCs向内皮细胞(endothelial cells,ECs)分化的潜能和内皮细胞的特征性鉴定方法.方法 采集犬髂骨骨髓15~20 mL,全骨髓10%FBS DMEM培养液进行原代培养.将第2代纯化的BMSCs细胞悬液接种于含VEGF、bFGF的DMEM/F12培养液(细胞接种密度为1×106·mL-1)体外诱导培养.对细胞形态特征进行观察,对诱导分化的细胞行CD31、vWF、VEGFR-2荧光免疫蛋白检测.结果 原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长.诱导分化后的细胞光镜下单层融合生长,呈铺路石样形态;电镜下细胞呈多边形,可见特征性的Weibel-Palade小体;经成血管内皮细胞诱导培养7～14 d后,BMSCs诱导分化细胞CD31、vWF和VEGFR-2的表达呈阳性.结论 犬BMSCs易于体外分离培养及扩增,经VEGF、bFGF体外定向诱导后的细胞具有血管内皮细胞的特征且细胞纯度高、数量大.
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骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮样细胞的实验研究
体外诱导入骨髓的间充质干细胞(MSCs)分化成为血管内皮样细胞(ELCs),探讨骨髓来源的MSCs作为组织工程血管种子细胞的可行性.通过密度梯度离心,分离人骨髓的单个核细胞,DMEM贴壁培养MSCs,多次传代贴壁培养纯化MSCs,包含血管内皮生长因子(VEGF)、人成纤维细胞生长因子(hFGF)、胰岛素样生长因子一1(IGF-1)和人表皮生长因子(hEGF)的EBM-2培养基诱导MSCs向ELCs分化,倒置显微镜观察ELCs的形态,流式细胞仪检测ELCs的血管内皮钙粘素(VE-cadherin)、CD133和CD31表达,免疫荧光检测ELCs的CD31和血管性假血友病因子(vWF)表达.结果显示,贴壁培养的MSCs呈长梭形,旋涡状生长,经过诱导细胞形态发生改变,细胞形态变圆,与血管内皮细胞(ECs)相似;流式细胞仪结果显示ELCs表达ECs的特异性标志物CD31和VE-cadherin,不表达CD133;免疫荧光结果也显示ELCs表达CD31和vWF.结果表明:MSCs具有定向诱导分化为ECs的潜能,MSCs来源的ELCs具有与ECs相似的细胞生物学特征,提示骨髓来源的MSCs可作为血管组织工程的种子细胞.
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基于兔BMSCs预血管化细胞膜片的体外构建
目的 探讨构建预血管化细胞膜片新方法的可行性. 方法 取3周龄日本大耳白兔分离培养BMSCs,并在VEGF和bFGF作用下诱导其向血管内皮样细胞(endothelial like cells,ECs)分化(实验组),以未诱导细胞作为对照组,倒置显微镜下观察细胞形貌,并行血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)及CD31免疫荧光染色观察.将第2代BMSCs以9×104个/cm2密度体外培养14 d形成未分化细胞膜片,将BMSCs诱导14 d获得的ECs以5×104个/cm2密度接种在细胞膜片上(A组)培养3、7、14d,以单纯未分化的兔BMSCs膜片为B组,BMSCs诱导14d获得的ECs单独培养为C组.倒置显微镜下观察血管网络形成,并行CD31免疫荧光染色及组织学观察. 结果 原代BMSCs呈长梭形;诱导分化后细胞形态发生改变,呈“铺路石”样.实验组vWF及CD31免疫荧光染色均呈阳性,而对照组均呈阴性.A组BMSCs诱导14d后的ECs接种至未分化的BMSCs膜片上3、7、14d后,细胞形态发生改变,镜下可见空泡样、网状结构形成;CD31免疫荧光检测显示了进行性管腔形成过程;HE染色显示了微血管管腔的形成.B、C组未观察到类似改变. 结论 BMSCs在合适条件下可诱导形成ECs;将由BMSCs诱导分化形成的ECs接种至未分化BMSCs膜片上,可在体外形成具有血管网络结构的预血管化膜片,为工程化血管组织构建提供了新方法.
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人抗凝血酶Ⅲ基因转染血管内皮样细胞的表达
目的 观察人抗凝血酶Ⅲ(human antithrombin-Ⅲ,hAT-Ⅲ)基因转染血管内皮样细胞(VELCs)后的表达情况. 方法 体外分离、培养和扩增的人骨髓间充质干细胞(BMMSCs),定向诱导分化产生血管内皮样细胞,然后将血管内皮样细胞随机分为实验组和对照组,实验组采用脂质体转染方法,将携带hAT-Ⅲ基因的质粒DNA转染血管内皮样细胞,分别于转染后72h、96h,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western-Blotting)和发色底物法检测细胞hAT-Ⅲ的表达;对照组细胞采用空白TE缓冲液代替质粒DNA,其余方法完全同实验组. 结果 RT-PCR显示实验组细胞扩增出hAT-Ⅲ特异片段,对照组阴性;免疫组化显示实验组细胞阳性表达hAT-Ⅲ,对照组阴性;Western-Blotting显示实验组细胞培养上清液中有hAT-Ⅲ特异条带,对照组阴性; 发色底物法检测显示实验组细胞hAT-Ⅲ活性为9.50%±1.52%,对照组为1.83%±1.17%,两组比较差异有统计学意义(t=7.910,P<0.01). 结论 hAT-Ⅲ基因可以成功转染血管内皮样细胞并进行表达.
