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苏木不同提取物对小鼠胸腺和T细胞增殖功能的影响
目的:观察苏木不同提取物对小鼠胸腺组织、外周T细胞增殖和产生INF-γ的影响.方法:制备苏术不同提取物分别给予灌胃小鼠,7 d后取小鼠胸腺称重计算胸腺指数;采用MTT法测定小鼠脾T细胞的增殖能力;用双抗体夹心ELISA法测定T细胞培养上清中产生INF-γ的含量.结果:苏木不同提取物不仅对胸腺重量具有明显的抑制作用,而且还对T细胞的增殖和产生INF-γ的能力具有明显的抑制作用.其中苏木醇提取物和正丁醇提取物对T细胞的抑制作用较强.
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rhG-CSF动员对供者T细胞增殖和细胞毒的影响
为了解rhG-CSF动员对供者T细胞增殖和细胞毒的影响,在rhG-CSF动员前和动员后第5天抽取供者外周血分离单个核细胞(PBMNC),在PBMNC中加入CD3单克隆抗体和rhIL-2以激活T细胞,培养96小时后检测T细胞增殖率和细胞毒性,并进一步对动员前后激活的T细胞用流式细胞术检测Fas表达率,用RT-PCR检测穿孔素(perforin)和Fas配体(FasL)mRNA表达情况,应用放射免疫分析方法检测细胞的γ干扰素(IFN-γ)分泌情况.结果发现,供者外周血T细胞增殖能力在应用rhG-CSF后下降(68.5±15.1)%(P＜0.05);动员后CD3单克隆抗体和rhIL-2激活后T细胞对K562细胞的细胞毒性均比动员前细胞有显著减弱(P＜0.05);动员前后T细胞在激活后的Fas表达率无明显差异(P＞0.10);动员前后T细胞在激活后均表达perforin mRNA,不表达FasL mRNA;动员前T细胞激活后分泌IFN-γ的能力明显高于动员后(P＜0.01).结论:rhG-CSF动员致使供者T细胞在CD3单克隆抗体与rhIL-2激活后的增殖率和细胞毒性下降.
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rhGM-CSF和rhIL-4诱导的髓性白血病细胞刺激自体T细胞增殖与IFN-γ分泌作用
为了研究rhGM-CSF和rhIL-4诱导的髓性白血病细胞刺激自体T细胞的增殖作用和IFN-γ的分泌作用,运用rhGM-CSF和rhIL-4在体外进行CML和AML外周血MNC培养,培养的第7天运用流式细胞术测定CML和AML细胞的CD80,CD86和HLA-DR表达;以诱导的白血病细胞作为刺激细胞,自体T细胞作为反应细胞,在体外进行混合淋巴细胞培养(MLR),测定自体T细胞的增殖情况和IFN-γ的分泌情况.结果显示,rhGM-CSF和rhIL-4明显上调CML细胞HLA-DR,CD80和CD86的表达,并明显上调AML细胞的CD80与CD86表达;诱导后的白血病细胞刺激自体T细胞明显的增殖和促进IFN-γ的分泌(CML组)作用.结论:rhGM-CSF和rhIL-4诱导的CML和AML细胞可能具有向自体T淋巴细胞呈递抗原的能力.
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马钱子碱对再生障碍性贫血患者T细胞分泌功能和增殖能力的影响
本研究观察不同浓度马钱子碱对再生障碍性贫血(aplastic anenia,AA)患者T琳巴细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4的水平及其增殖的影响,以探讨马钱子治疗AA的作用机制.AA患者及健康志愿者各10例,分离外周血T琳巴细胞并对其进行培养和纯化.将AA患者T细胞分为马钱子碱0、100、200和400μg/ml4个干预组;健康志愿者T细胞为正常对照组,不作干预.培养72小时后,用ELISA法检测各组细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-4的水平,MTT比色法检测AA各组T细胞的增殖状况.结果表明,AA患者T细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平较正常对照组均明显升高,而IL-4水平较正常对照组明显降低;AA患者T细胞经马钱子碱作用后,TNF-α、IFN-γ水平均明显降低,且呈剂量依赖关系,而作用前后IL-4水平无明显变化.马钱子碱100、200和400μg/ml浓度对AA患者T细胞生长抑制率分别为(13.61±4.31)%、(14.28±4.31)%、(15.12±4.56)%,3个组间的比较无明显差异.结论:马钱子碱通过降低AA患者TNF-α、IFN-γ造血负调控因子的水平和抑制T细胞增殖而发挥治疗作用.本研究为马钱子治疗AA提供了实验依据.
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5-氟尿嘧啶对肝癌小鼠髓系抑制性细胞表达及功能的影响
目的：研究5-氟尿嘧啶（5-FU ）对原位肝癌小鼠组织中髓系抑制性细胞（ myeloid-derived suppressor cells ，MDSCs）的分布、比例变化及免疫功能的影响作用。方法采用H22细胞株原位移植法建立小鼠原位肝癌模型，造模后第7天将模型小鼠随机分为4组，分别给予0．4 ml PBS，10、30和50 mg/kg剂量的5-FU，连续给药10 d，同时设正常对照组，停药后采用免疫组织化学染色法测定小鼠肝脏中MDSCs的分布，用流式细胞术检测小鼠脾脏中MDSCs的比例，ELISA法检测小鼠血清中高表达精氨酸酶 I（Arginase -I，Arg-I）及IFN-γ的含量，化学比色法检测小鼠血清中一氧化氮合酶（ nitric oxide synthetase ，NOS）的活性，MTT法比较各组小鼠T细胞的增殖功能。结果模型小鼠随着给药剂量的升高，肿瘤体积缩小，肝脏与腹腔粘连程度减弱；模型组小鼠肝脏及脾脏中MDSCs比例均高于正常对照组（P＜0．05），其中PBS组比例高，随着5-FU剂量的升高，MDSCs比例逐渐下调，除肝脏PBS组与10 mg/kg组外，其他组间差异有统计学意义（P＜0．05）；模型组Arg-I的含量及NOS的活性均高于正常对照组（P＜0．05），其中PBS组含量高，随着5-FU剂量的升高，二者逐渐下调，组间差异有统计学意义（P＜0．05）；模型组血清IFN-γ的含量均低于正常对照组（P＜0．05），其中PBS 组含量低，随着5-FU剂量的升高，IFN-γ含量逐渐上调，除PBS组与10 mg/kg组外，其他组间差异有统计学意义（P＜0．05）；T细胞增殖试验，脾细胞培养24 h时各组间增殖指数差异均无统计学意义，48 h时模型组均低于正常组，其中PBS组低，随着5-FU剂量升高，增殖指数逐渐升高，除PBS组与10 mg/kg组外，其他组间差异有统计学意义（P ＜0．05）；肝、脾MDSCs比例与 Arg-I含量及NOS活性呈正相关，与血清IFN-γ含量及48 h T细胞增殖指数呈负相关。结论5-FU在一定程度上减少肝癌小鼠肝脏、脾脏中MDSCs的数量，缓解MDSCs对肝癌小鼠的免疫抑制作用，提高肝癌小鼠的免疫功能，抑制肿瘤的生长，并在该实验剂量范围内具有一定的量效依赖性。
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重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的表达及活性研究
目的表达、分离、纯化重组人Ⅱ型胶原250-270多肽(recombinant human collagen type Ⅱ peptide 250-270,rhCⅡ250-270)并研究其对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)和关节滑液单个核细胞(SFMC)中特异性T细胞的活化作用. 方法利用DNA合成、聚合酶链式反应、重组DNA等基因工程的方法构建含有人Ⅱ型胶原功能性多肽CⅡ250-270多聚基因的表达载体pGEX-4T-1,转化E.coli BL21,融合表达目的蛋白,经Glutathione Sepharose○R 4B亲和层析柱分离纯化,12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶薄层扫描测量其相对分子质量(Mr)和纯度.以不同浓度(0.1、1.0、10、100、1000μg/ml)的6聚rhCⅡ2 50-270和化学合成的CⅡ250-270刺激体外培养的RA患者PBMC和SFMC,等浓度的GST蛋白和PBS作为阴性对照,流式细胞仪测定刺激前后2组培养细胞中T细胞CD69的表达率,以分析其对特异性T细胞的活化作用. 结果融合表达的目的产物经SDS-PAGE分析,相对分子质量(Mr)大小约为43×103,与预期相符.分离纯化的6聚rhCⅡ250-270经SDS-PAGE凝胶薄层扫描,纯度为89%,浓度为2.1mg/ml.FACS分析:经100μg/ml浓度的6×rhCⅡ250-270刺激3d后,RA(9例)患者PBMC和SFMC T细胞中CD69+细胞率分别为(18.05±4.34)%和(25.17±4.89)%,显著高于同型对照GST组水平[(1.02±0.48)%,(1.25±0.23)%,(P＜0.01)],而与化学合成的CⅡ250-270组无统计学差异.进一步分析表明,同组患者滑液中CD69的表达显著高于外周血(P＜0.01). 结论纯化的6聚rhCⅡ250-270多肽经初步验证具有活化RA患者特异性T细胞的特性.
关键词： 类风湿关节炎 Ⅱ型胶原 重组人Ⅱ型胶原250-270多肽 T细胞增殖 -
高迁移率蛋白族B1通过调控p53表达抑制T细胞增殖
目的:探讨高迁移率蛋白族B1 (HMGB1)对T细胞的增殖抑制作用及其分子机制.方法:将培养的Jurkat细胞分为对照组、HMGB1 (100 ng/ml) 12、24、48 h组,HMGB1组加入HMGB1培养相应时间;将细胞分为对照组、HMGB1 10、100、1 000 ng/ml组,予不同浓度HMGB1培养24 h;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测各组细胞增殖率,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞中p53mRNA、磷酸化p53及p53总蛋白的表达水平.将载有p53 shRNA、p53 mRNA表达序列及空白质料的病毒转染入Jurkat细胞中,并选择100 ng/ml HMGB1刺激24 h,采用同样方法检测细胞增殖率.后,将细胞分为正常组、HMGB1组、SB203580[p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂]+HMGB1组进行相应处理.收集各组细胞,RT-PCR和Western blot法检测p53 mRNA、磷酸化p53及p53总蛋白的表达水平.结果:HMGBl (100ng/ml)刺激细胞24、48 h后细胞增殖率降低,较正常组差异有显著性(P＜0.05);100、l 000 ng/ml HMGB1刺激细胞24 h后,增殖率明显下降,与正常组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).HMGB1 (100 ng/ml)刺激细胞后,p53 mRNA、磷酸化及总蛋白表达水平在24、48 h逐步上升,且有明显统计学意义(P＜0.05);HMGB1刺激24 h,10、100 ng/ml HMGB1刺激组细胞p53 mRNA、p53磷酸化及总蛋白表达水平较正常组显著上升,但1 000 ng/mlHMGB1没有明显变化;在不同转染组中,予HMGB1刺激细胞,空载组增殖率降低,而p53 shRNA表达组细胞增殖趋于正常,p53 mRNA过表达组增殖率较空载组下降更为明显.Jurkat细胞在p38 MAPK阻断剂和HMGB1共同作用后,p53 mRNA、磷酸化及总蛋白表达水平比HMGB1刺激组明显下降(P＜0.05).结论:胞外HMGB1可通过诱导p38 MAPK信号通路激活p53蛋白,抑制T细胞增殖.
关键词： 高迁移率族蛋白B1 P53 p38丝裂原活化蛋白激酶 T细胞增殖 -
苯并噻唑衍生物BD759抗T细胞增殖的机制研究
目的 探讨新型苯并噻唑衍生物BD759抑制T细胞增殖的作用机制.方法 流式细胞术检测T细胞增殖、CD25表达及细胞周期.酶联免疫吸附法测定BD759对活化T细胞分泌白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-17A及干扰素-γ等细胞因子的影响.结果 BD759抑制抗人CD3和CD28mAbs刺激的T细胞增和混合淋巴细胞反应,IC50分别为(3.5±0.7)和(3.3±0.9) μmol·L-1.BD759对人静息T细胞和外周血单个核细胞无细胞毒性.BD759不抑制活化的T细胞表达CD25和分泌细胞因子白细胞介素-2、白细胞介素-4及白细胞介素-10,但显著抑制白细胞介素-6、白细胞介素-17A和干扰素-γ的产生,并且阻滞细胞周期于G0/G1期.结论 新型苯并噻唑衍生物BD759不影响T细胞的活化,但通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制活化的T细胞增殖,并抑制白细胞介素-6、白细胞介素-17A和干扰素-γ等促炎细胞因子的分泌.BD759有望作为先导化合物,开发用于自身免疫性疾病与器官移植的新型药物.
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外用广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑制小鼠变应性接触性皮炎的激发
目的 研究外用广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)抑制剂苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-门冬氨酰氟甲基酮(Z-VAD-FMK)对小鼠变应性接触性皮炎(ACD)激发阶段的抑制作用,探讨其对T细胞的作用.方法 以2,4二硝基氟苯(DNFB)制作小鼠经典ACD模型,于激发前外用不同浓度的Z-VAD-FMK,以耳肿度、双耳重量之差及组织切片中同一位置双耳双面距离之差为指标,观察Z-VAD-FMK对小鼠ACD激发阶段的抑制作用；以酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠耳皮损中T细胞因子干扰素γ(INF-γ)及白细胞介素2(IL-2)的含量,以实时反转录PCR( real-time RT-PCR)方法检测上述因子mRNA水平(实验结果以“相对于每百万管家基因的拷贝数”表示)；进行局部淋巴结分析(LLNA),以5-溴脱氧尿核苷(BrdU)-流式细胞术检测耳引流淋巴结中淋巴细胞增殖活性,以流式细胞术检测淋巴细胞表面活化标记.结果 1.25 mmol/L Z-VAD-FMK组小鼠耳肿度为(12.6±1.2)×10-2 mm,双耳重量差为(3.1±0.2)mg,镜下双耳双面距离差为(12.1±1.1)×10-2 mm,均低于阴性对照组[(17.4±1.6)× 10-2mm,(4.2±0.3) mg,(16.7±1.5)×10-2mm;q =3.25、2.98、3.12,均P＜0.05].1.25 mmol/L Z-VAD-FMK组小鼠耳皮损中INF-γ与IL-2mRNA及蛋白的表达均低于阴性对照组[ INF-γ mRNA:152±12比220±15,IL-2 mRNA:96 ±8比156±11,q=3.15、3.42; INF-γ蛋白:(856±45) pg/ml比(1180±58)pg/ml,IL-2蛋白:(167±12) pg/ml比(225±16) pg/ml,q=3.11、3.14；均P＜0.05].1.25 mmol/L Z-VAD-FMK组小鼠耳引流淋巴结中T细胞内掺入的BrdU的平均荧光强度明显低于阴性对照组(185±15比298±21,q=3.02,P＜0.05),T细胞3种表面活化标记CD69、CD25与Ia阳性细胞的百分率亦均明显低于阴性对照组(7.8％±0.7％比10.5％±1.0％,9.8％±0.8％比14.5％±1.1％,31.2％±2.8％比46.5％±3.2％,q =3.16、3.52、3.11,均P＜0.05).结论 在小鼠ACD激发前外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以抑制小鼠皮损局部及耳引流淋巴结中T细胞的增殖与活化,从而抑制小鼠ACD的发生.
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冲击波通过ATP释放、P2受体及激活p38MAPK激酶促进T细胞增殖和分泌白细胞介素2
背景:以往研究发现,冲击波可通过激活有丝分裂原激活蛋白激酶p38(p38MAPK),增强CD3和CD28激活的T细胞增殖和分泌白细胞介素2.目的:观察细胞内的ATP向外释放,是否为冲击波增强T细胞功能的潜在机制.设计:以细胞为观察对象,分组对照重复测量观察.单位:吉林大学第一医院骨科研究室.材料:KDE-2001体外冲击波碎石机(北京中科建安医疗技术公司制造).MAPKp38抑制剂:SB203580 1 mg(BioSource Inc.,Camarillo,CA);检测磷酸化的p38MAPK试剂盒(Cell Signaling Tehchmology,Inc.U.S.A.);P2受体抑制剂:suramin 50 mg(BIOMOL Research Laboratories Inc,PA),用1.749 2 mL的IMDM培养基将50 mg的suramin配成0.02 mol/L的溶液.ATP酶:apyrase 200 U(Sigma,U.S.A.);P2X7受体阻滞剂:KN-62(BioSource Inc.,Camarillo,CA);p38 MAPK抑制剂:SB203580 1 mg(BioSource Inc.,USA*542 Flynn Roas,Camarillo,CA);检测ATP的生物荧光试剂盒/ATP Bioluminescence Assay Kit CLS Ⅱ(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany).方法:实验于2005-01/2006-12在吉林大学第一医院骨科研究室完成.①采用体外冲击波碎石机(工作电压7 kV、电容0.3μF时,冲击波正相压强23 MPa,能量密度0.18 mJ/mm2)作用于T细胞,冲击波作用50～400次.②用特异性的ATP试剂盒检测低能冲击波是否引起T细胞(人外周血单个核细胞和Jurkat T细胞)分泌ATP.③设无拮抗剂和抑制剂的阴性对照组.用人外周血单个核细胞检测低能冲击波对激活的T淋巴细胞增殖的影响,用Jurkat细胞检测低能冲击波对T淋巴细胞分泌白细胞介素2的影响,用抗-p38 MAPK抗体及抗-磷酸化的p38MAPK(Thr180/Tyr182)抗体通过免疫印迹法测定Jurkat T细胞上的p38 MAPK的表达及磷酸化.主要观察指标:T细胞外的ATP含量、细胞悬液中的白细胞介素2的含量、细胞的增殖和细胞p38MAPK的磷酸化程度.结果:①冲击波作用100,150,200,250,300,360和400次时较无冲击波作用时细胞外的ATP的含量明显增加(P＜0.01),并且ATP的增加含量和冲击波的作用次数有依从关系.②加入apyrase,KN-62,suramin的植物血凝素激活的外周血单个核细胞细胞或CD3和CD28激活的Jurkat T细胞,在能量密度为0.18 mJ/mm2的冲击波作用100,150,200,250,300,330次时,细胞对3H-TdR掺入量比没有加入apyrase、KN-62或suramin的阴性对照组低(P＜0.01),细胞上清液中的的细胞介素-2的活性含量表现为明显增高(P＜0.01).加入ATP、KN-62或suramin后,冲击波激活Jurkat T细胞的p38 MAPK的程度明显降低.结论:①低能冲击波能损伤细胞膜而不损伤其他细胞器,引起T淋巴细胞内的ATP过多向细胞外分泌,细胞外过量的ATP过多地激活了P2X7受体,激活细胞内的大量的p38 MAPK,后磷酸化的p38MAPK作为协同刺激因子增强激活的T淋巴细胞增殖及分泌白细胞介素2.②在低能冲击波对T淋巴细胞的功能调节上,T细胞分泌的ATP起到非常重要的作用.
关键词： 促分裂原活化蛋白激酶p38 白细胞介素2 T细胞增殖 ATP -
大肠癌患者外周血来源树突状细胞对T细胞活化作用的研究
目的 比较无血清培养液AIM-V和RPMI1640+胎牛血清(FBS)培养液培养大肠癌患者外周血来源树突状细胞(DCs)的形态和免疫表型,检测DCs对T细胞的活化作用.方法 对2003年3月至2004年10月首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科收治的10例大肠癌患者,采集其外周血分离单核细胞,分别使用2种细胞培养液进行体外培养.观察细胞形态,检测细胞表面CD1a,CD80,CD86,CD83,CD14及HLA-DR的表达.再用丝裂霉素作用后的DCs作为刺激细胞,按照刺激细胞:反应细胞(S:R)1:1,1:10,1:20,1:40,1:80的比例进行同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测DCs刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果 大肠癌患者外周血单核细胞经2种细胞培养液培养后都可以诱导出DCs.细胞外型均呈毛刺状.细胞均表达CD1a、CD80、CD86和人类白细胞抗原(HLA-DR),不表达CD14、CD83,为不成熟DCs的特点.两组DCs细胞表型表达差异无显著性(P＞0.05).按S:R不同比例进行同种异体MRL所得刺激指数分别为2.7,4.1,3.1,2.5,1.6,表明树突状细胞(DCs)在不同比例下都刺激T细胞增殖.结论 使用AIM-V无血清培养液和传统的含FBS细胞培养液均可成功诱导培养大肠癌患者外周血来源的DCs,但使用AIM-V可以降低含血清培养液应用人体后引起的过敏反应等风险,更适合DCs的临床使用,可以替代含血清培养液.MLR结果显示,DCs在各种S:R比例下均有刺激T细胞增殖的能力,但S:R比为1:10时佳.
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人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用
目的:构建人细胞因子IL-21表达载体并在Hela细胞中稳定表达,分析rhIL-21体外促T细胞增殖作用.方法:以已构建的pMD-IL21为模板,PCR扩增成熟IL-21 cDNA的编码框序列并构建到真核表达载体pCDNA3.1/hismyc-B中.挑出阳性克隆进行扩增,脂质体转染入Hela细胞中并以G418加压筛选.有限稀释法、RT-PCR及Western blot筛选出稳定表达的细胞株.培养上清液经金属离子螯合层析分离纯化后,SDS-PAGE、Western blot鉴定.MTT法测定其与抗CD3单克隆抗体共刺激T细胞增殖活性.结果:SDS-PAGE、Western blot显示Mr为18 000的带有myc重组人IL-21融合蛋白(rhIL-21);并成功地获得hIL21稳定表达细胞株.rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用.结论:获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子,为进一步研究其功能奠定基础.
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小鼠可溶性CD83对树突状细胞表达共刺激分子和共刺激活性的影响
目的:研究可溶性小鼠CD83(mCD83)对树突状细胞(DC)表达共刺激分子及共刺激活性的影响.方法:克隆mCD83基因,构建mCD83胞外功能区与人IgG1α Fc段融合基因的真核表达载体pmCD83-hIg,并在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白.采用ELISA、Western blot和RT-PCR技术检测mCD83-hIg融合基因在COS-7细胞中的表达.用mCD83-hIg处理小鼠DC细胞系(DC2.4)采用流式细胞术检测DC细胞周期、细胞凋亡和共刺激分子CD80、CD86的表达影响;采用混合白细胞培养试验,检测mCD83-hIg对DC2.4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的影响.结果:酶切和序列测定鉴定显示构建的真核表达载体完全正确;mCD83-hIg对DC2.4细胞周期和细胞凋亡无影响,但可下调DC2.4表面共刺激分子CD80和CD86的表达;mCD83-hIg处理过的DC2.4刺激同种异基因T细胞增殖及产生IL-2和IFN-γ的能力显著下降.结论:mCD83-hIg可抑制DC表达共刺激分子并下调DC共刺激活性,从而抑制同种异基因T细胞增殖和产生细胞因子.
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γ-氨基丁酸对人细胞因子诱导的杀伤细胞增殖的影响
目的:研究γ-氨基丁酸(GABA)及A受体激动剂(THIP)对人细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)增殖和凋亡的影响以及作用机制.方法:在体外用不同浓度的GABA和THIP与人CIK细胞作用后,用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)检测人CIK细胞的增殖能力、细胞凋亡、细胞周期和免疫表型的变化.结果:GABA能显著抑制CIK细胞的生长(P＜0.01),且具有浓度依赖性,THIP对GABA的抑制细胞增殖有明显促进作用;GABA显著影响细胞周期比例的分布,促进细胞凋亡;GABA显著降低CIK细胞表面分子CD28、CD25的表达,并能被THIP增强.结论:GABA可抑制CIK细胞增殖,诱导其凋亡,降低其细胞表面CD28、CD25的表达,抑制T淋巴细胞活化,具有免疫抑制作用.这些作用通过T淋巴细胞上的GABAA受体介导.
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利用SUMO表达系统高效可溶表达人白细胞介素15及其活性研究
目的:探讨重组人白细胞介素15(rhIL-15)的表达条件、纯化工艺并进行生物活性鉴定.方法:采用RT-PCR方法从正常成人外周血淋巴细胞中扩增出人白细胞介素15(hIL-15) cDNA,克隆到pSUMO Vector中,构建rpSUMOhIL-15重组质粒.将转化重组质粒的工程菌诱导表达,超声破碎后取菌液上清,经过亲和层析、酶切、亲和层析得到成熟蛋白.高效液相色谱进行纯度分析;利用rhIL-15促进T细胞增殖、rhIL-15诱生的NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力鉴定其生物活性;荷瘤鼠实验研究rhIL-15抗肿瘤作用.结果:经纯化后得到rhIL-15,其分子量大小为14.4 kD,蛋白纯度在95%以上,具有显著刺激T细胞增殖和NK细胞杀伤肿瘤细胞效果.动物实验结果显示其具有明显的抗肿瘤作用.结论:经过纯化获得高纯度和高生物学活性的rhIL-15,且具有明显增强NK细胞杀伤、刺激T细胞增殖和抗肿瘤的活性,为细胞因子联合其他方法治疗肿瘤等疾病提供了实验基础.
关键词： rpSUMOhIL-15 融合蛋白 T细胞增殖 NK细胞杀伤活性 抑制肿瘤作用 -
黄芪多糖定向诱生脐血来源树突状细胞及其对T细胞增殖作用的研究
目的:观察黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)体外对脐血单核细胞定向分化为树突状细胞(DCs)及其对T细胞的刺激增殖作用.方法:无菌条件下采集脐血,密度梯度离心法获得脐血单个核细胞分为3组,实验组:在含有APS(浓度为100 mg/L)的RPMI1640完全培养液中培养;阴性对照组:在无药物的RPMI1640完全培养液中培养;阳性对照组:在含有细胞因子(IL-4、GM-CSF、TNF-α)的RPMI1640完全培养液中培养;培养过程中用倒置光学显微镜和扫描电镜观察细胞形态;收集部分培养第12天的细胞利用流式细胞仪检测各组细胞表面CD1a、CD80、CD83和CD86的表达;收集实验组培养第12天的细胞(DCs),作为刺激细胞;分离制备健康志愿者异基因外周血单核细胞(MNC),作为反应细胞混合培养,MTT比色法检测DCs对同种异体T细胞的刺激增殖作用.结果:在培养的第72小时后实验组和阳性对照组细胞形态开始变化,随着培养时间的延长,树突状结构更加明显,第12天细胞呈典型的树突状细胞形态;阴性对照组细胞生长缓慢,培养至第12天细胞呈梭形巨噬细胞形态.培养至10天的实验组细胞扫描电镜下呈典型的树突状细胞形态.培养12天实验组、阳性对照组细胞分别高表达DCs特异性抗原CD1a、CD80、CD83和CD86,与阴性对照组对应比较差异均有显著性(P＜0.01);实验组与阳性对照组之间比较无统计学意义(P＞0.05).混合淋巴细胞反应显示经黄芪多糖诱生的DCs对同种异体T淋巴细胞具有明显刺激增殖作用.结论:黄芪多糖及细胞因子体外均可诱导脐血单核细胞(DCs前体细胞)定向分化为功能性(成熟)DCs;黄芪多糖诱生的DCs具有明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,且随DCs细胞数量的增加而作用增强.
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小鼠骨髓来源的树突状细胞体外诱导分化的实验研究
目的研究小鼠骨髓树突状细胞体外诱导分化、成熟及对T细胞增殖的影响,为进一步研究树突状细胞的功能及临床肿瘤治疗的应用提供技术方法.方法应用IL-4、GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5～7 d,镜下观察细胞形态学变化;培养至第5～6 d,加入黑色素瘤(B16)冻融抗原继续培养1～2 d,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86,并与同种异体T细胞混合培养72 h,终止培养前16 h加入3H-TdR(0.5μCi/孔),γ-液体闪烁仪测定cpm值.结果IL-4、GM-CSF培养3 d可见细胞形态发生改变,细胞形状不规则,培养5～6 d时,有刺状突起、拉长,为典型树突状细胞形态学特征;抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达,IL-4+GM-CSF+TNF-α组(61.68%,71.25%)及IL-4+GMCSF+冻融抗原组(63.11%,76.88%)明显高于对照组(2.41%,3.88%)及单纯IL-4+GM-CSF培养组(21.86%,28.69%)(P＜0.001),IL-4+GM-CSF+TNF-α组与IL-4+GM-CSF+冻融抗原组比较CD83、CD86表达没有显著性差异;液闪仪检测结果显示,IL-4+GM-CSF+冻融抗原组刺激T细胞增殖的能力明显强于其他组,且有显著性差异(P＜0.001,P＜0.05).结论小鼠骨髓细胞体外培养可以成功诱导扩增出足够量树突状细胞,经肿瘤抗原刺激后绝大部分成熟.
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慢性粒细胞白血病树突状细胞对T细胞增殖作用的研究
目的体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血单个核细胞(PBMCs)为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及对T细胞刺激增殖作用进行研究.方法利用GM-CSF、IL-4、TNF-o体外定向诱导生成树突状细胞,对所诱生的细胞进行细胞表型及形态检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性,应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力.结果 CML患者PBMCs在体外可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs(CML DCs).CMLDCs对自体T细胞有明显刺激增殖作用,而CML细胞无此作用.CMLDCs刺激同一异体T细胞增殖能力弱于正常DCs,但当培养体系中加入300 U/mi干扰素-α(IFN-α)时可使其刺激能力接近正常DCs.结论 CML DCs 具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,但对异体T细胞的刺激作用弱于正常DCs,IFN-α可提高CML DCs刺激T 细胞增殖能力.
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Caspase在T细胞活化与增殖中的作用
半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶( caspases)是一类同源蛋白酶,主要参与细胞的凋亡过程.近年来的研究表明,该家族部分成员在T细胞活化与增殖中亦发挥重要作用,主要体现在以下3个方面:T细胞活化过程中检测到多种caspases活性；caspase-8失活后导致了人与鼠T细胞免疫的缺陷；体外实验中,caspase抑制剂能够阻断抗CD3单抗及超抗原引起的T细胞的活化与增殖.目前,部分体内实验已经证实了caspase抑制剂抗免疫反应及抗炎症反应的有效性,这为免疫性及炎症性疾病提供了新的治疗思路,为研制新型抗免疫、抗炎药物提供了依据.
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壳寡糖抗肿瘤作用的实验研究
目的 观察壳寡糖对S180荷瘤鼠免疫功能的影响.方法 分组给药10 d后,处死小鼠测定壳寡糖对肿瘤生长的影响;采用3H-TdR法测定T淋巴细胞增殖情况及NK细胞活性.结果 壳寡糖抑瘤率为42.03％;壳寡糖对荷瘤鼠T细胞增殖有明显的促进作用;壳寡糖可明显提高荷瘤鼠NK细胞活性.结论 壳寡糖可以通过增强T细胞及NK细胞活性调节免疫功能,达到抗肿瘤作用.
