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津力达颗粒联合通心络胶囊对2型糖尿病大鼠胰腺组织自噬的影响
目的:观察中药复方津力达颗粒联合通心络胶囊对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠胰岛β细胞超微结构损伤情况、胰岛β细胞功能及胰腺组织自噬相关蛋白Beclin-1,Atg7,p62表达的影响.方法:采用高脂喂养结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 30 mg· kg-1ip建立T2DM大鼠模型,15只雄性SD大鼠设为正常组正常饲料喂养,75只雄性SD大鼠高脂饲料喂养6周后STZ腹腔注射,根据血糖随机分为:模型组,津力达组(JLD),通心络胶囊组(TXL),联合用药组(JT),吡格列酮组(PLZ),JLD组于模型成功后给予津力达颗粒(3.0 g·kg-1·d-1),TXL组于模型成功后给予通心络胶囊(0.4 g·kg-1·d-1),JT组于模型成功后给予津力达颗粒(3.0 g·kg-1·d-1)加通心络胶囊(0.4 g·kg-1·d-1),PLZ组于模型成功后给予吡格列酮(10 mg·kg-1·d-1),连续ig6周后,检测空腹血糖及血清胰岛素以计算胰岛β细胞功能指数,电镜观察各组大鼠胰岛β细胞超微结构;Western blot方法检测胰腺组织Beclin-1,Atg7,p62蛋白的表达变化.结果:与正常组相比较,模型组大鼠胰岛β细胞损伤减轻,胰岛β细胞功能指数明显降低,胰腺组织Beclin-1,Atg7蛋白表达明显减少,p62蛋白表达明显增加(P＜0.01);与模型组比较,各给药组大鼠胰岛功能指数升高,Beclin-1,Atg7表达升高,p62蛋白表达减少(P＜0.01),与JLD,TXL组比较,JT组Beclin-1,Atg7表达升高,p62蛋白表达减少(P＜0.05).结论:津力达颗粒联合通心络胶囊可以提高胰岛β细胞功能指数,其作用可能与促进胰岛自噬有关,而维持胰腺组织自噬水平可能是延缓糖尿病进展的有效措施.
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ATG5和ATG7在糜烂型口腔扁平苔藓中的表达
目的 检测ATG5、ATG7在糜烂型口腔扁平苔藓组织中的表达,探讨细胞自噬在口腔扁平苔藓恶变中的作用.方法 采用免疫组织化学方法,检测ATG5、ATG7在正常口腔黏膜、糜烂型口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中的表达.结果 ATG5、ATG7在三种不同组织中均呈阳性表达,在糜烂型口腔扁平苔藓组织中表达量升高,在口腔鳞状细胞癌组织中表达下降,差异有统计学意义(P<0.05).结论 糜烂型口腔扁平苔藓组织中存在细胞自噬的异常.
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Beclin1及Atg7在维格列汀保护db/db小鼠胰岛β细胞中的作用
目的 探讨维格列汀对糖尿病小鼠胰岛β细胞自噬相关因子表达及β细胞存活的影响.方法 16只db/db小鼠按血糖水平分为糖尿病组(DM组,n=8)及维格列汀治疗组(VT组,n=8),同龄野生型小鼠作为正常对照组(NC组,n=8),其中DM组及VT组间血糖水平无显著差异(t=1.918,P＞ 0.05).VT组小鼠给予维格列汀(35 mg·kg-1·d-1)灌胃,DM组及NC组小鼠给予生理盐水灌胃.干预6周后,经心脏穿刺取血检测随机HbA1c水平；采用免疫荧光技术分析胰岛形态及结构；TUNEL法检测β细胞凋亡；RT-PCR技术分析胰岛β细胞自噬相关基因6(Beclin1)及自噬相关基因7(Atg7)mRNA表达水平；免疫组化技术分析β细胞Beclin1蛋白表达水平.结果 DM组小鼠血HbA1c水平明显高于NC组；VT组小鼠血HbA1c水平较DM组降低(F=579.19,P＜0.01).免疫荧光及细胞凋亡检测发现,与NC组相比,DM组胰岛α及β细胞分布紊乱,凋亡增加(P＜0.001)；与DM组相比,VT组胰岛α及β细胞分布趋于正常,β细胞凋亡减少(F =37.25,P＜0.01).RT-PCR结果显示,DM组小鼠胰岛β细胞Beclin1及Atg7 mRNA表达显著高于NC组(P ＜0.001);VT组中上述基因mRNA表达较DM组降低(F=61.35,41.43,P均＜0.001).免疫组化分析结果显示,DM组Beclin1蛋白表达高于NC组,而VT组中表达较DM组降低(F=15.92,P＜0.05).结论 维格列汀治疗可下调Beclin1及Atg7在糖尿病小鼠β细胞中的表达,该作用可能与其改善胰岛结构及促进β细胞存活有关.
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新风胶囊治疗大鼠骨关节炎
目的 主要观察新风胶囊(黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣)对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白IgG1、IgG2α及细胞因子IL-4、TNF-α,软骨、胸腺、脾脏自噬基因(Atg5、Atg7、Atg12)的表达的影响.方法 大鼠随机设正常对照组和模型对照组(均予生理盐水)、氨基葡萄糖对照组,以及新风胶囊组,每组10只.除正常对照组外,采用关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸方法制成骨关节炎大鼠模型,造模后第14天给药30 d.以光镜对大鼠软骨进行Man-kin标准评分;采用ELISA法检测血清细胞因子IgG1、IgG2α、IL-4,和TNF-α;采用RT-PCR对骨关节炎大鼠软骨、胸腺、脾脏中的自噬相关基因Atg5、Atg7和Atg12进行检测.结果 给药后,与正常组比较,模型组体质量明显下降,Mankin评分明显升高,血清IgG1、IgG2α、TNF-α升高,IL-4降低,在胸腺、脾脏、软骨等各组织中,Atg存在不同程度的降低(P＜0.05或P＜0.01);与氨基葡萄糖组比较,新风胶囊组体质量明显升高,Mankin评分明显降低,IL-4及Atg5、Atg7、Atg12升高(P＜0.01或P＜0.05).结论 新风胶囊可以抑制炎症反应,调节大鼠整体自噬水平,达到治疗骨关节炎.
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白花丹醌对肝癌细胞SMMC-7721凋亡和自噬的影响
目的 研究白花丹醌对肝癌细胞SMMC-7721凋亡和自噬的影响.方法 MTT法检测白花丹醌对SMMC-7721细胞增殖的影响;透射电镜观察细胞凋亡与自噬的形态变化;免疫荧光检测自噬蛋白LC3的变化;qPCR法检测自噬基因Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的变化;Western blot检测自噬蛋白LC3、Beclin1、Atg7、Atg5的表达水平.结果 白花丹醌对SMMC-7721细胞增殖有抑制作用,且呈剂量-时间依赖关系;透射电镜下,白花丹醌组细胞凋亡形态明显,并出现自噬体;免疫荧光显示,白花丹醌处理后细胞LC3蛋白的表达上升;qPCR结果表明白花丹醌组自噬基因Beclin1、Atg7、Atg5 mRNA的表达增加;Western blot提示白花丹醌分别与凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和自噬抑制剂3-MA联合使用时,能够影响自噬蛋白Atg5、Atg7、LC3-Ⅱ、Beclin1的表达水平.结论 白花丹醌促进SMMC-7721肝癌细胞的凋亡与自噬,其机制可能与上调SMMC-7721细胞自噬有关基因及蛋白的表达水平有关.
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COPD 合并肺性脑病患者脑脊液β-GBA、Atg7、p62水平变化及意义
目的：观察慢性阻塞性肺疾病（ COPD）合并肺性脑病患者脑脊液中神经元自噬相关标志物β-葡糖脑苷酶（β-GBA）、Atg7、p62水平变化，并探讨其临床意义。方法选择COPD合并肺性脑病者50例（观察组）及单纯COPD患者50例（对照组），采集患者脑脊液，ELISA法检测脑脊液中的β-GBA、Atg7，Western blot法检测p62蛋白。结果观察组脑脊液β-GBA为（34．6±6．8）pg／mL、Atg7为（12．4±3．2）pg／mL、p62为0．35±0．05，对照组分别为（15．5±3．6）pg／mL、（2．8±0．6）pg／mL、0．23±0．03，P均＜0．05。结论 COPD合并肺性脑病患者脑脊液β-GBA、Atg7、p62蛋白水平升高，神经元自噬在肺性脑病的发生、发展中起重要作用。
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自噬基因ATG7、ATG12在成人急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞中的表达及意义
目的:探讨自噬基因ATG7、ATG12在成人急性淋巴细胞白血病(ALL)骨髓单个核细胞中的表达及意义.方法:收集2015年1-12月在我院确诊的成人ALL患者骨髓标本80例,将其分为初治组42例,缓解组25例,难治复发组13例,选取同期非肿瘤性疾病患者骨髓标本30例作为对照组,应用淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞,经单丹磺酰尸染色后使用流式细胞仪检测细胞自噬率,使用RT-PCR技术检测自噬基因ATG7和ATG12mRNA的表达水平.结果:流式细胞仪检测结果显示,初治组、难治复发组的自噬率显著高于对照组的自噬率(P＜0.05),缓解组的自噬率与对照组相比无显著性差异(P＞0.05),难治复发组的自噬率显著高于缓解组(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,初治组、难治复发组的ATG7 mRNA和ATG12 mRNA的相对表达量显著高于对照组(P＜0.05),缓解组的ATG7 mRNA和ATG12 mRNA的相对表达量与对照组相比无显著性差异(P＞0.05),难治复发组的ATG7mRNA和ATG12mRNA的相对表达量显著高于缓解组(P＜0.05).结论:成人ALL骨髓单个核细胞的自噬活性增强,自噬基因ATG7、ATG12 mRNA表达上调,提示自噬基因ATG7、ATG12激活诱导的自噬活性增强可能与成人ALL的发生、发展和复发有关.
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pGenesil-1-Atg7-shRNA真核表达载体的构建
目的 利用RNA干扰技术,构建pGenesil-1质粒载体介导靶向自噬基因Atg7的shRNA真核表达载体. 方法 根据GenBank中Atg7基因的cDNA序列(NM 001136031),设计有小发卡结构的三条寡核苷酸序列,连接到空载体pGenesil-1中,转化到JM109菌株,选取阳性克隆,进行酶切鉴定和DNA测序分析. 结果 经双酶切结果显示合成的shRNA序列成功连接到pGenesil-1质粒载体中,DNA测序结果证实干扰序列和目的序列相同,重组载体pGenesil-1-Atg7-shRNA构建成功. 结论 成功构建干扰人Atg7基因的重组表达载体,为研究Atg7蛋白的生物学功能提供了研究基础.
关键词： Atg7 RNA干扰 pGenesil-1 自噬 载体构建 -
姜黄素通过提高自噬体形成相关蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用
目的:全面研究姜黄素(curcumin)对N2a/APP695swe细胞自噬作用的影响,进一步探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制.方法:将细胞分为4组:野生型对照组(WT组)、空白对照组(Control组)、溶剂对照组(Sham组)、姜黄素处理组(Curcumin组,5μmol/L).Western blot分别检测自噬标志性蛋白LC3Ⅱ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Atg蛋白Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1的表达;免疫荧光法进一步验证SQSTM1蛋白的表达.各组分别转染细胞自噬体指示探针(GFPLC3)和溶酶体红色探针(LysoRed)后,激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的数量检测自噬流.结果:Western blot结果表明,Curcumin组LC3Ⅱ蛋白表达量较对照组明显增高(0.59±0.03 vs.0.11 ±0.01,P=0.000);同时,Curcumin组SQSTM1蛋白表达量较对照组明显降低(0.19±0.04 vs.0.66±0.05,P=0.000).免疫荧光实验再次验证了SQSTM1蛋白的这个表达趋势.共聚焦显微镜观察发现,与对照组相比,Curcumin组细胞内自噬体数量增加(154.67±7.37 vs.89.00±7.21,P=0.000),同时自噬溶酶体数量也显著增加(84.67±12.50 vs.42.33±6.51,P=0.000).Western blot进一步检测发现,与对照组相比,Cureumin组Atg蛋白Beclin1、Atg7、Atg16L1的表达均明显增加(0.55±0.09 vs.0.10±0.02,P=0.000;0.89±0.12 vs.0.39±0.07,P=0.000;0.36±0.07vs.0.13±0.02,P=0.003),而Atg5和Atg12改变差异无统计学意义(0.79±0.12 vs.0.79±0.10,P=0.470;0.94±0.13 vs.0.87±0.16,P=0.587).结论:姜黄素增强N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与提高自噬体形成相关蛋白Beclin1、Atg7、Atg16L1的表达有关.
