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大鼠缺血心肌微血管内皮细胞的培养和鉴定
目的 建立大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs)培养模型,为进一步研究其生物学特征提供实验基础.方法选取220~280 g成年雄性SD大鼠,结扎法建立心肌缺血模型,植块法培养结扎后24 h、3 d、7 d的心肌缺血模型大鼠CMECs,倒置相差显微镜观察培养细胞的形态学特征,观察不同时间点缺血模型CMECs生长状况,免疫细胞化学方法显示CMECs特异性抗原.结果 镜下观察部分CMECs刚游离出组织块时呈星形或多边形,当细胞生长至亚融合状态呈短梭形并呈铺路石样,部分区域可见管腔样或血管网络状结构,具备典型微血管内皮细胞特征;心肌缺血7 d时,缺血心肌组织CMECs密度大;免疫细胞化学染色鉴定,Ⅷ因子、CD31相关抗原均为阳性,阳性率分别为(95.1±1.2)%、(95.0±1.6)%.结论 本方法可获得纯度高、结构和功能良好的缺血CMECs,为缺血性心血管疾病研究奠定基础.
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小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定
目的:建立简单易行的小鼠胰星状细胞(PSCs)原代培养方法,为胰腺纤维化研究提供可靠的体外细胞模型.方法:采用植块法结合酶消化法进行培养,即在无菌条件下取小鼠正常胰腺组织,经过剪碎、胰蛋白酶消化后植入培养瓶中贴壁培养,并予限制性条件培养基进行纯化,通过倒置生物显微镜对传代前后所培养细胞进行形态学、自发荧光及油红染色脂滴的观察,并结合细胞免疫化学和免疫荧光等方法来鉴定小鼠PSCs.结果:小鼠原代PSCs培养3-4 d后油红染色阳性,并能观察到自发荧光现象;传代后的细胞形态主要表现为体积较大,伪足发达,呈"星芒状"或"乌贼样";细胞免疫荧光染色和细胞免疫化学染色显示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性.结论:植块与酶消化结合法分离小鼠胰腺星状细胞,简单实用、成功率高,能够满足体外实验的要求.
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钙离子跨缝隙连接在内皮细胞与平滑肌细胞间传递的研究
目的：探讨钙离子能否跨缝隙连接在内皮细胞与平滑肌细胞间进行传递。
方法：本实验采用植块法分别培养大鼠主动脉内皮及平滑肌细胞，将内皮细胞与平滑肌细胞分别接种至transwell insert膜的两侧以建立内皮细胞与平滑肌细胞双层共培养模型，并用透射电镜观察两种细胞在transwell insert膜两侧生长情况，将细胞负载Fluo-3后，在用ETA (10-5M)和/或ETB(10-5M)受体阻断剂处理一种细胞后用ET-1(10-7M)刺激另一种细胞在激光共聚焦显微镜测定未刺激细胞内荧光强度变化，并观察18α-GA及肝素对上述变化的影响。 -
植块法在成骨细胞培养中的应用
目的:探讨植块法培养成骨细胞的可行性.方法:取10例先天性脊柱侧凸患者髂骨松质骨,应用植块法分离培养成骨细胞.培养过程中观察细胞形态学变化,并用碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙素表达、骨钙素免疫荧光检测、钙结节观察等方法对培养细胞进行鉴定.结果:应用植块法培养获得了较多的原代细胞,光镜下呈典型的成骨细胞形态,碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原和骨钙素表达及钙结节形成等观察结果均证实所培养细胞表现成骨细胞特性.结论:植块法成骨细胞培养体系方法简单,在获得大量原代成骨细胞的同时,较好地保持了其生物学特征,是一种较理想的人成骨细胞培养方法.
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植块法与酶消化法结合培养原代大鼠雪旺细胞
目的:探讨利用植块法与酶消化法相结合培养大鼠原代雪旺细胞的可行性;并研究其增殖规律.方法:取10只新生2～3d的SD大鼠双侧坐骨神经;剥除神经外膜;剪成约1mm3大小的碎块;用0.03%胶原酶和0.25%胰蛋白酶按1:2对神经碎块消化12min;加入少量含10%胎牛血清的DMED培养基小心吹打细胞及组织块;再植于培养皿中培养.用S-100免疫组化染色鉴定雪旺细胞;结合Hoechst3342染色计算其纯度;在显微镜下确定细胞数量.结果:在植块培养24h后即有大量细胞迁出;2～6d细胞生长迅速;10d以后生长较为缓慢;其倍增时间为2-3d.经S-100染色证实所培养细胞为雪旺细胞;结合Hoechst3342染色可得其培养8d时纯度为95.1%;传代后纯度可达96.3%.10只新生鼠培养12d后可得细胞数约为4.8×106个.结论:利用植块法与酶消化法相结合的方法可以迅速获得大量高纯度的雪旺细胞;其增殖速度在前6d快;倍增时间为2.3d.
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改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞
目的 探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞(SCs)的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较.方法 取新生3～5d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs.培养7d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量.用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度.结果 改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度快,可获取(1.85 ±0.13)×106个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取(1.10±0.10) ×106个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度慢,可获取(0.77±0.03) ×106个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义(P＜0.01).S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为(95.73±1.51)％,普通消化复合植块法为(84.66±2.68)％,经典植块法为(74.50±4.23)％,3种方法比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础.
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植块法体外培养大鼠肾小球系膜细胞
肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)是肾脏领域开展一系列基础研究的重要平台,已日益受到重视.然而尽管GMC的原代培养技术已较成熟,但我们发现采用经典的培养方法仍存在许多技术上的瓶颈,成功率并不高.为此,我们实验室尝试采用植块法培养大鼠GMC,取得了满意的结果,现介绍如下.
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人脐带间充质干细胞分离培养方法的优化
目的:优化人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分离培养的方法.方法:无菌条件下剔除剖腹产胎儿脐带动静脉,用牙剪子剪为约1mm3但彼此相连的组织块,得到贴壁细胞,采用半量换液进行原代及传代培养.用流式细胞仪检测其免疫表型.结果:成功从人脐带中分离纯化得到UC-MSCs,呈条形和成纤维细胞样的两种形态.UC-MSCs高度表达CD105、CD73、CD44、CD90,极少数表达CD45、CD34、CD14和HLA-DR.结论:建立出一种快捷经济的UC-MSCs体外分离培养方法.
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雪旺氏细胞体外培养不同方法的比较
雪旺氏细胞(Schwann cells,SCs)在维持周围神经功能及周围神经损伤后再生的过程中发挥重要的作用.周围神经受损后能较好地再生.研究证明,周围神经这种自身修复能力主要依赖于SCs提供了适宜神经再生的微环境[1～3].近年SCs在组织工程中作为重要的种子细胞应用于周围神经的损伤后修复,有较多的相关研究[4].但是,应用于移植所需的细胞量大,对细胞的纯度以及活性的要求较高,因此,高效的SCs体外分离培养方法是其应用于移植研究的重要前提,也是SCs应用于科研和临床的关键.在实验中我们对SCs体外培养的两种主要方法即反复植块法[5]和综合纯化法,进行了比较,具体如下.
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瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法
血管内皮细胞体外培养使深入研究内皮细胞成为可能.目前人脐静脉、牛或猪主动脉内皮细胞培养已被广泛应用,但存在价格昂贵,来源困难,及制作动物模型诸多不便的缺点.目前研究领域多采用大鼠作为实验动物,因此进行大鼠主动脉内皮细胞体外培养无疑具有广泛的应用价值.但因其分离培养困难仍少应用.有学者利用植块法进行分离[1～3],但该技术常出现多种细胞混杂生长的现象,其中外膜成纤维细胞生长迅速,是常见的污染细胞.本文在Nicosia等[4]报道的基础上进行瞬间热处理改良,以减少在原代培养中成纤维细胞迁出量,便于进一步纯化.
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改良的酶消化后植块法体外培养雪旺细胞
目的 观察改良的酶(浓度为2g/L的胶原酶)消化后植块法体外培养雪旺细胞(SCs)效果,探讨高效获取高纯度、高活性SCs的培养纯化方法.方法 取新生SD大鼠坐骨神经,剥离神经外膜,剪块,分别采用单酶消化后植块法与双酶消化法进行培养.以活细胞计数和S-100单抗标记相结合判断SCs增殖和纯化程度,比较2种方法的优劣.结果 改良的单酶消化后植块法可获取3.5x106个SCs,成活率为96%,纯度达94%以上:双酶消化法约获取3.0×106个SCs,成活率为92%,纯度达90%.结论 采用改良的酶消化后植块法培养SCs,可较快得到数量多、纯度高的SCs,符合实验要求,值得推广应用.
