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小鼠胰星状细胞的分离培养及鉴定
目的:建立简单易行的小鼠胰星状细胞(PSCs)原代培养方法,为胰腺纤维化研究提供可靠的体外细胞模型.方法:采用植块法结合酶消化法进行培养,即在无菌条件下取小鼠正常胰腺组织,经过剪碎、胰蛋白酶消化后植入培养瓶中贴壁培养,并予限制性条件培养基进行纯化,通过倒置生物显微镜对传代前后所培养细胞进行形态学、自发荧光及油红染色脂滴的观察,并结合细胞免疫化学和免疫荧光等方法来鉴定小鼠PSCs.结果:小鼠原代PSCs培养3-4 d后油红染色阳性,并能观察到自发荧光现象;传代后的细胞形态主要表现为体积较大,伪足发达,呈"星芒状"或"乌贼样";细胞免疫荧光染色和细胞免疫化学染色显示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达阳性.结论:植块与酶消化结合法分离小鼠胰腺星状细胞,简单实用、成功率高,能够满足体外实验的要求.
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胰星状细胞对胰腺癌细胞株Patu8988侵袭和转移的影响
目的:探讨永生化人胰星状细胞(IPSC)对胰腺癌细胞株Patu8988侵袭和转移的影响.方法:制备IPSC上清,用IPSC上清和Patu8988共培养,以单独培养的Patu8988为对照,比较实验组与对照组细胞的增殖、黏附能力.侵袭、迁移能力,克隆形成以及抵抗H2O2诱导的Patu8988凋亡能力.结果:与单独培养的胰腺癌细胞株Patu8988相比,IPSC上清对胰腺癌细胞株Patu8988细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭能力及克隆形成能力有促进作用(均p<0.05),并能抑制H2O2诱导的Patu8988的凋亡(P<0.05).结论:胰星状细胞可能通过增强胰腺癌细胞株Patu8988的增殖、黏附、迁移、侵袭能力及克隆形成能力,并抑制其的凋亡,在胰腺癌的发展和转移中起重要作用.
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胰星状细胞与胰纤维化发生机制的研究进展
胰纤维化是慢性胰腺炎的主要病理特征,胰星状细胞(PSC)的活化在胰纤维化发生发展过程中起着关键作用.细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板生长因子(PDGF)、白介素(IL)和瘦素(Leptin)等在PSC增生、活化和细胞外基质(ECM)产生的过程中通过相应的信号途径发挥不同作用.信号级联终通过转录因子如核转录因子KB(NF-κB)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)和Krüppel样转录因子(KLF)家族成员等,与特定的DNA"靶位"结合对致纤维化靶基因发挥调控作用.
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高糖对大鼠胰星状细胞增殖和细胞外基质合成的影响
目的探讨高糖刺激对大鼠胰星状细胞(pancreatic stellate cell, PSC)增殖和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成的影响.方法分离培养大鼠PSC,取传第3～5代细胞,分别用正常葡萄糖(5.6 mmol/L葡萄糖)(正常对照)、高葡萄糖(25 mmol/L葡萄糖)(高糖组)和甘露醇(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L甘露醇)(等渗对照组)处理5天后,用MTT法、3H-Thymidine掺入和3H-Proline掺入法分别检测细胞增殖、DNA合成和总胶原合成,同时用放免法检测细胞培养上清中Ⅲ型前胶原氨基末端多肽(amino-terminal propeptide of type Ⅲ procollagen, PⅢNP)和透明质酸(hyaluronic acid, HA)含量.结果与等渗对照组比较,高糖组PSC增殖、DNA合成、总胶原合成和细胞上清HA含量均显著增加(P<0.05),但细胞上清PⅢNP含量无显著性差异(P>0.05).结论高糖可刺激PSC增殖与胶原合成,参与PSC活化.体内高糖血症可能是PSC活化的机制之一.
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大鼠胰星状细胞的分离与培养
目的建立大鼠胰星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)的分离培养方法.方法大鼠胰腺组织经胶原酶和链霉蛋白酶E消化后,用Nycodenz不连续密度梯度离心法分离PSC,在328 nm紫外光激发下观察细胞的自发荧光现象,并以免疫组化技术检测结蛋白(desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,同时观察培养细胞的形态和生长特性.结果新鲜分离的大鼠PSCs产率、活力和纯度分别约为2.5×106/g胰腺、95%和90%.培养的PSCs可自发活化,表达α-SMA,细胞由静止型转化为肌成纤维样细胞表型.原代培养10天后细胞纯度＞95%,传代培养后细胞纯度可达99%以上.结论利用Nycodenz密度梯度离心方法可成功分离大鼠PSCs,其细胞产率、活力和纯度均可满足体外研究需要.
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人、鼠胰星状细胞3种细胞标志物desmin、GFAP、α-SMA的表达
目的研究人和大鼠胰星状细胞(PSCs)在培养过程中细胞标志物表达的动态变化.方法人和大鼠胰腺组织经胶原酶、链霉蛋白酶E和DNase I联合消化后,采用Nycodenz不连续密度梯度离心方法分离PSCs,获得的细胞采用离心淘洗技术进行纯化.用激光共聚焦扫描显微镜观察新鲜分离细胞的维生素A(VitA)自发荧光现象,用免疫组化法检测细胞标志物--结蛋白(desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达.细胞接种培养后,观察细胞形态和生长特性,采用Western和Northern分析分别检测细胞标志物和I型前胶原α1链基因表达的动态变化.结果采用离心淘洗技术获得的人和大鼠PSCs纯度分别可达85%以上和95%以上.新分离的人和大鼠PSCs胞浆内有VitA自发性蓝绿色荧光.新分离大鼠PSCs表达desmin和GFAP,不表达α-SMA,而人PSCs均不表达desmin、GFAP或α-SMA.在体外培养过程中,大鼠PSCs表达desmin和GFAP逐渐减弱,但人和大鼠PSCs均开始大量表达α-SMA蛋白和Ⅰ型前胶原基因.结论利用离心淘洗技术可获得高纯度的人和大鼠PSCs.人和大鼠PSCs细胞标志物表达存在种属差异,但它们活化后均高表达α-SMA蛋白和I型前胶原基因.
关键词： 胰星状细胞 结蛋白 神经胶质原纤维酸性蛋白 α-平滑肌动蛋白 -
血管紧张素Ⅱ诱导胰腺星状细胞炎性活化的分子机制研究
目的探讨血管紧张素Ⅱ对大鼠胰星状细胞(PSC)核因子κB(NF-κB)信号转导通路活化的影响.方法采用电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测细胞NF-κB的DNA结合活性,Western印迹方法检测NF-κB抑制蛋白(IκBs)降解.单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因和蛋白表达分别采用Northern印迹和ELISA方法检测.结果血管紧张素Ⅱ可诱导大鼠PSC内NF-κB发生双相活化,活化高峰分别出现在15 min和6 h后.NF-κB活化伴有IκBα和IκB β联合降解.抗氧化剂吡咯烷二硫基甲酸盐(PDTC)、二碘基苯(DPI)和N-乙酰丝氨酸可明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的NF-κB活化,提示氧化应激反应在NF-κB活化中发挥了重要作用.NF-κB抑制剂MG132和PDTC可显著下调血管紧张素诱导的MCP-1基因表达.结论血管紧张素Ⅱ可通过氧化应激机制活化PSC内NF-κB信号通路,诱导MCP-1表达,从而参与胰腺炎症和纤维化的发生.
关键词： 血管紧张素Ⅱ 胰星状细胞 核因子κB 单核细胞趋化蛋白-1 -
血管紧张素Ⅱ受体在大鼠胰星状细胞上的表达及其调节
胰腺存在局部特异的肾素-血管紧张素系统(RAS)[1],此系统参与胰腺纤维化的发生[2].由于胰星状细胞(PSC)是参与胰腺纤维化发生的主要效应细胞,故推测RAS的致胰纤维化作用可能是通过直接作用于PSC实现的.为此,本研究探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的2种主要受体亚型AT1和AT2在大鼠PSC的表达情况,并在此基础上探讨其表达的调控机制.
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血管紧张素Ⅱ诱导大鼠胰星状细胞增殖和胶原合成
目的:研究血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对大鼠胰星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)增殖和活化的影响.方法:取第4～7代培养的大鼠PSCs,采用无血清DMEM培养液培养48 h使细胞同步静止化后,换含1、10和100 nmol/L Ang Ⅱ的无血清培养液继续培养24 h或48 h;另外,在加入100 nmol/L Ang Ⅱ无血清培养液前加入100 nmol/L AT1受体拮抗剂ZD7155或AT2受体拮抗剂PD123319.分别采用[3H]-胸嘧啶核苷掺入、[3H]-脯氨酸掺入、Western印迹和Northern印迹法动态检测细胞DNA合成速率、胶原合成速率、α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型前胶原mRNA表达.结果:与正常对照组比较,1 nmol/L Ang Ⅱ刺激24 h后细胞DNA合成率无显著增加(P>0.05),而10和100 nmol/L处理组细胞DNA合成率显著增加(P值均<0.05);刺激48 h后,1、10和100 nmol/L Ang Ⅱ处理组细胞胶原合成率和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平均明显增加(P值均<0.05),但α-平滑肌动蛋白表达无明显变化(P值均>0.05).与Ang Ⅱ(100 nmol/L)处理组比较,Ang Ⅱ(100 nmol/L)+ZD7155(100 nmol/L)处理组细胞DNA合成率、胶原合成率和Ⅰ型前胶原mRNA表达水平均显著下降(P值均<0.01),而Ang Ⅱ(100 nmol/L)+PD123319(100 nmol/L)处理组均无明显变化(P值均>0.05).结论:Ang Ⅱ通过AT1受体介导,可剂量依赖性诱导大鼠PSCs增殖和胶原合成,从而参与胰腺纤维化的发生.
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一种小鼠胰腺星状细胞分离培养方法
本研究旨在建立一种简便的小鼠胰腺星状细胞分离培养方法,现报道如下.一、材料与方法我们参考吴恺等分离培养大鼠胰腺星状细胞的方法,建立起一种新的小鼠胰腺星状细胞分离培养方法:组织块分离法.具体方法如下:首先采用多聚赖氨酸包被培养瓶,多聚赖氨酸可以使组织贴壁更加牢靠,同时增加细胞贴壁能力.其次根据胰腺星状细胞与胰腺内其他细胞的生长条件差异[1],纯化胰星状细胞,并加入胰酶抑制剂,防止自身消化导致的细胞损伤.
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大鼠胰星状细胞体外分离培养的实验研究
目的体外分离培养胰星状细胞(PSC)以建立合适的体外模型,为进一步研究胰纤维化的分子发生机制打下实验基础.方法采用改良Apte MV酶消化法体外分离培养PSC,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色和荧光倒置显微镜观察自发绿色荧光对原代培养的PSC加以鉴定.结果 PSC与肝星状细胞(HSC)具有相似的特征,细胞呈梭形或星形,细胞骨架蛋白GFAP染色阳性,由于胞质内含维生素A脂滴,在荧光倒置显微镜下于328 nm波长处可见自发绿色荧光.结论改良酶消化法可用于体外分离培养PSC,PSC分离培养的成功为进一步研究PSC活化与抑制信号通路的分子机制提供了体外模型.
